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パート5では、特別編としてエキソソームの蛍光標識について紹介します。実験の1例として、HeLa細胞をレシピエント細胞に使う「In vitro実験:エキソソームの標識法とレシピエント細胞への取り込みのトレーシングプロトコール」を説明します。またオプションとして、生細胞内でのエキソソームの蛍光標識法についても、プロトコールの1例を紹介します。Read More
最新の高分離能型フローサイトメトリーでは、ナノサイズの小胞体(免疫標識済)を定量的に解析可能と報告されていますが(1, 2)、一般的なフローサイトメトリーでは300nm以下の小胞体を単独に検出することは難しく、100nm以下の微細なエキソソームの解析には工夫が必要です。Read More
パート4では、特定のタンパク質をターゲットとして、免疫吸着法による追加の分画法を紹介しています。前回は、細胞から分泌される小胞体について概説し、サブタイプ分画に使用するエキソソームマーカーの候補についてご紹介しました。サブタイプによる分画は、それ以降のアプリケーションによって回収方法が分かれます。今回は、Western / qRT-PCR / Sequencing解析用のエキソソームサブタイプの回収について説明します。Read More
これまで様々なサンプルからのエキソソーム回収法やエキソソーム分画中のRNAやタンパク質の解析について説明しました。今回から数回にわたり、エキソソーム濃縮サンプルを使ったサブタイプ解析についてご紹介します。サブタイプ解析では、どのような解析法を使うかにより分画法が異なります。Read More
前回まで、エキソソーム中のRNA Cargoの解析について説明してきました。ここでは、エキソソーム中のProtein cargoの解析法として、一般的なタンパク質解析の手法であるWestern blotting法を紹介します。この方法は、よく利用される技術ではありますが、注意も必要です。Read More
第4話では、精製した“RNA cargo(カーゴ)”中のマイクロRNA(miRNA) cargoの定量解析について説明しました。今回は、“RNA cargo(カーゴ)”中のmRNA cargoの定量解析について説明します。TaqMan® Gene Expression Assaysを用い、リアルタイムPCR解析について紹介します。 Read More
第3話では、“RNA cargo(カーゴ)”の精製について説明しました。今回は、miRNA cargoの定量解析について説明します。具体的には、TaqMan® MicroRNA Assaysを用い、リアルタイムPCR解析の方法を紹介します。プロトコールだけでなく、RNAサンプルの取り扱いの注意点や、実験データの解釈についても考察しています。Read More
パート1では、培養上清やさまざまな体液サンプルからのエキソソームの濃縮・回収方法について紹介しましたが、パート2では、回収したエキソソーム内のRNA(RNA cargo)に絞って解析方法を紹介します。具体的には、ターゲットのRNA cargoの定量を目的に、エキソソームからのRNA精製からリアルタイムqRT-PCR法による発現解析までのワークフローです。 Read More
近年、従来の光学顕微鏡の分解能の壁を越える超解像顕微鏡技術が開発され、これらの技術を用いて各社から超解像顕微鏡が発売されており、これが生物学分野のブレイクスルーとなっている。本稿では、構造化照明(Structured Illumination)により従来の光学顕微鏡の分解能を約2倍に向上させた超解像顕微鏡N-SIMを用いて、新しい封入剤ProLong® Diamond、SlowFade® Diamondで封入した標本を観察したので紹介する。寄稿:高塚賢二氏(株式会社ニコン マイクロスコープ・ソリューション事業部) Read More
現在、エキソソームの回収法として、超遠心機を用いたサイズ分画法が汎用されています。しかしこの方法は、時間がかかり、高度なテクニックを必要とします。これに対して、スタートのサンプルに応じたTotal Exosome Isolation 試薬を使えば、培養液や、血清などの体液サンプルから、単純な操作でインタクトな状態のエキソソームを回収できます。Read More