【第6回】「パート3：“Protein cargo”の解析方法」

（電気泳動ゲル）
基本的には、 ターゲットタンパク質検出に適した電気泳動ゲルを自由に選択できます。
弊社製品を使う場合、CD63, CD9, CD81などのエキソソームマーカータンパク質では以下の電気泳動ゲルが適しています：

• Novex® 4-20% Tris-Glycine Mini Protein Gels, 1.0 mm, 12 well *　（製品番号：EC60252BOX）

*上記のカタログ番号のゲルは、厚さ1mm、12wellsタイプのミニゲル（10枚入り）です。電気泳動には専用のタンク（ XCell SureLock® Mini-Cell, cat# EI0001)が必要です。

（電気泳動バッファー）
MESまたはMOPS SDS Running Buffer で電気泳動します。ターゲットタンパク質が低分子の場合は、MES bufferの方が適しています。以下のStock試薬を1×の濃度の希釈して使用します：

• Novex® Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X)　（製品番号：LC2675）

（タンパク質のサイズマーカー）
BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder（製品番号：10748-010）が利用可能です。

（一次抗体）
（エキソソームマーカーを検出する場合）
弊社から販売している 以下のエキソソームマーカー抗体を用いる場合、変性／非還元条件で電気泳動を行ってください。

• Exosome CD63 Antibody (for western, human), 製品番号： 10628D
• Exosome CD9 Antibody (for western, human), 製品番号： 10626D
• Exosome CD81 Antibody (for western, human), 製品番号： 10630D

（その他のタンパク質を検出する場合）
基本的にどのようなタンパク質に対する抗体も利用可能です。
ただし使用する抗体は1種類ではなく、2～3社から販売されているものをテストすることをお勧めします。抗体濃度は十分に留意してチェックしてください。

その他の抗体をご利用になる場合は、最適なゲル条件（還元・非還元、変性・未変性ゲルななど）の検討を行われることをお勧めいたします。使用される抗体の製造元に推奨条件を確認してください。

（検出方法）
発光検出（Chemiluminescence　detection)のご利用をお勧めしています。
エキソソームマーカータンパク質の検出では、以下のシステムを利用しています：

• HRP検出系では、SuperSignal™ West Dura (Trial kit 製品番号37071）、またはSuperSignal™ West Femto（Trial Kit, 製品番号： 34094)）を使用しています。
  2次抗体としてMouse TrueBlot® Ultra Ig HRP Secondary antibody (eBioscience , 製品番号： 18-8817)を使用しています。
• AP検出系ではWestern Breeze Chemiluminescence kit, anti-mouse（製品番号： WB7104）を使用しています（2次抗体がセットになっています）。

（スタートサンプル）
スタートサンプルは、試薬または超遠心法で回収したエキソソーム濃縮ペレットです。
ペレットの調製法は、パート1（エキソソームの濃縮・回収）を確認してください。
遠心で回収したペレットをWestern blotting 解析に適したBufferに懸濁します。

1. エキソソームペレットに、1× RIPA buffer （製品番号： 89900）を添加し、ピペッティングでミックスします。
   • 添加するbuffer量はスタートサンプル量に依存します。パート1のプロトコールの指示量を参考に加減してください。
   • （オプション） 100 × Protease inhibitorを Bufferに対して、1/100量添加します。
     Halt Protease Inhibitor Cocktail (100×) （製品番号： 87785）が利用可能です。

   注意：エキソソームペレットが、すでに1×PBS等に懸濁した状態の場合は、2× もしくは5× RIPA Bufferの濃縮Bufferを使用してください。

2. （オプション） 10秒間の超音波処理。
   
   
3. 氷中で15分間インキュベートします。

2. 75℃で 5分間 インキュベート

1. トランスファー
   電気泳動後のゲルをPVDFメンブレンへトランスファーします。
   トランスファーの方法は、一般的な方法で行います（セミドライ式、タンク式など）。

   参考： iBlot® 2 Gel Transfer Device（製品番号： iIB21001）を使用すれば、トランスファーは7分間程度で完了します。

2. ブロッキング

   • トランスファー処理後のPVDFメンブレンを、Wash Buffer （TBS-T Buffer *1）を入れた容器中で、室温、5分間振盪します。
   • PVDFメンブレンをBlocking buffer *2を入れた容器に移し、室温で１時間程度振盪し、非特異的な結合部位をブロックします。

   ＊1： TBS-T Buffer：25mM Tris HCl, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20, pH7.2
   ＊2： 5%スキムミルク/TBS-T や、SuperBlock Blocking Buffer（製品番号：37516, 37536）などが使えます。

3. 1次抗体反応
   

   • 希釈済みの1抗体液にメンブレンを移し、2～8℃で overnight インキュベートします。

     以下のエキソソームマーカーの抗体を使用する場合は、それぞれ以下の濃度になるようにBlocking bufferで希釈して使用します：

     1 µg/mL ： Exosome CD9 Antibody (for western, human), 製品番号： 10626D
     1 µg/mL ： Exosome CD81 Antibody (for western, human), 製品番号： 10630D
     1～2 µg/mL ： Exosome CD63 Antibody (for western, human), 製品番号： 10628D

     重要:抗体濃度は、使用する抗体、抗原、転写メンブレンなど、ウェスタンブロティングの条件によって異なります。最適な抗体濃度を検証実験を行って頂くことをお勧めします。

   • Wash Bufferでメンブレンを簡単に2回洗浄します。

   • Wash Bufferを入れた容器内でメンブレンを5分間振盪します。Wash Bufferを交換し、この操作を4～6回繰り返します。

     注意：Wash Bufferの液量や洗浄時間、回数によってバックグラウンドの軽減が図れます。

4. 2次抗体反応
   

   • 希釈済みの2次抗体溶液にメンブレンを移し、室温で1時間振盪します。
     重要：2次抗体の希釈倍率は使用するHRP標識抗体の力価、使用した1次抗体によっても異なってきます。
     なおSuper Signalを用いる場合は、以下が一般的な2次抗体の希釈率(濃度)になります。こちらをベースに最適化を行ってください：

     • ◎　SuperSignal West Femto
       1：100,000～1：500,000 (2.0～10 ng/mL)

     • ◎　SuperSignal West Dura
       1：50,000～1：250,000 (4.0～20 ng/mL)

   • メンブレンをWash Bufferに移し、室温で5分以上振盪します。
     1回に使用するWash Bufferの量を多めすると洗浄効率が良くなります。Wash bufferは4～6回交換します。

5. 化学発光基質の反応
   

   • 検出試薬の調製：
     SuperSignal kit付属のLuminol / Enhancer Solution と Stable Peroxide Solutionを等量ずつ混合します。溶液量はメンブレン全体が均一に浸る程度の量（メンブレン1cm²当たり0.125mL以上）を用意します。

   • メンブレンを検出試薬に移し、5分間振盪します。

   • メンブレンを検出試薬から取り出し、ラップで包みます。
     ラップとメンブレンの間に気泡が入らないようにします。

6. バンドの検出（イメージャー / X線フィルム）
   

   • イメージャーを用いて、バンドの検出する場合：
     Thermo Scientific myECL Imager （製品番号：62236） を使うと、X線フィルムより感度の高い検出が可能です。

   • X線フィルムを用いて検出する場合：
     メンブレンの表面（タンパク質がトランスファーされた面）の上にX線フィルムをセットし、1～10分間、露光します。