Qubit蛍光定量システムのサンプルデータ

Qubit Fluorometerの正確性と精度。正確性は、Qubit dsDNA HSアッセイを使用して真の濃度からの平均偏差として評価され、精度はQubit dsDNA BRアッセイを使用してさまざまな濃度の複製間の変動係数（CV）として評価されました。偏差率の低さはQubit Flex FluorometerおよびQubit 4 Fluorometerの正確性を示し、低いCV値はその精度（特にQubit Flexモデル）を表しています。試験した3つの装置のうち、他社の装置の正確性と精度がもっとも低くなっています。

Qubit dsDNAとUV吸光度の精度と感度の比較。Qubit dsDNA HSアッセイを使用し、既知濃度0.01～10 ng/μLのラムダDNAをn=10で調製し、Qubit Fluorometerで反復実験を行いました（青色のバー）。Fluorometerの操作は、標準的なキットプロトコルに従って行いました。同じ濃度のDNAを、微量分光光度計を用いて10回の反復でUV吸光度を測定し（青色のバー）、正確性と精度の両面で結果を比較しました。各バーは10回の反復の平均を表し、一方、エラーバー（Qubit測定ではほとんど識別できない）は標準偏差を表します。X軸のスケールは、Qubitアッセイチューブで希釈する前の出発サンプル中の既知のDNA濃度を表し、Y軸スケールは測定された濃度を示します。Qubit Fluorometerの測定は、UV吸光度測定よりも正確（y » x）、高感度（低濃度、挿入図）、高精度（エラーバーが非常に小さい）でした。

Qubit microRNAアッセイの正確性、精度、および感度。純粋なsiRNAを用いたQubit microRNAアッセイの正確性と精度をテストするために、6つの実験が行われました；典型的な実験結果をここに示します。この実験では、0.1 μg/mLから12 μg/mLまでの既知濃度のGAPDH siRNAの8リプリケートを、Qubit microRNAアッセイキットとQubit Fluorometerを用い、NanoDrop ND-1000分光光度計でA₂₆₀測定を行いました。NanoDrop装置の検出限界は1.5 μg/mLと報告されています；比較のため、より低いsiRNA濃度の結果を示しています。Qubit microRNAアッセイの精度は予測値の15%以内でした。CV（1標準偏差／8データポイントの平均）は0.63～2.9%でした。6つの実験すべてにおいて、Qubit microRNAアッセイの精度は予測値の15%以内で、CVは<5%でした。

Qubit microRNAアッセイの精度と範囲。純粋なsiRNAとmiRNAサンプルの濃度は、A₂₆₀が0.3～0.6となる濃度で、PerkinElmer™分光光度計の光学密度によって決定されました。次に、サンプルを希釈し、4種類の既知濃度のQubit microRNAアッセイでテストしました。結果は、（A）4種類の一本鎖siRNA分子、（B）2種類の二本鎖siRNAと2種類の二本鎖miRNAの正確な定量を示しました。

RNA IQアッセイ試薬の大きなRNAと小さなRNAに対する選択性。100 ng/µLのrRNA（E. coli）とさまざまな量のsiRNA（0～50 ng/µL）を含有するトリプリケートサンプルを、Qubit RNA IQアッセイを用いてQubit 4 Fluorometerのでアッセイしました。グラフは、これらのサンプルの（A）相対蛍光単位（RFU）と（B）IQスコアを示しています。このデータは、色素がそれぞれ大きなRNA（rRNAなど）および小さなRNA（siRNAなど）に特異的であり、IQスコアがサンプル中の大きなRNAの割合と強く相関していることを示しています。

Qubit RNA IQアッセイで測定したRNase AによるrRNA分解の経時変化。100 ng/µLのrRNA溶液のトリプリケートサンプルは、マルチプレックス色素とアッセイバッファーを含有する最終アッセイ溶液中で異なる用量のRNase Aとインキュベートしました。（A）RNase Aの投与量が多いほど、60分間でRNAの分解が速くなり、そのRNA IQスコアで反映されました。（B）10 fMのRNase Aに曝露すると、大きなRNAの蛍光は1時間かけて徐々に減少し、小さなRNAの蛍光はそれに対応して増加しました。（C）100 fMのRNase Aに曝露された場合、その変化はより速く起こりました。

RNA IQはRT-qPCRの結果と一致しますが、他社製装置AのRNAインテグリティナンバー（RIN）とは一致しません。ヒト肝臓から分離したTotal RNAを75℃でさまざまな時間熱処理し、他社Xの装置AとQubit RNA IQ Assayを用いて分析しました。RT-qPCR解析もRETROScript逆転写酵素とTaqMan hHIF1αアッセイおよびhGAPDHアッセイを用いて行いました。（A）装置Aのデータでは、時間の経過とともにrRNAのピークが急速に減少しており、RNAの完全性が劣化していることを示唆しています。（B）RIN（黒い点）とRNA IQ（灰色の三角形）を比較すると、40分時点のより詳細な結果も含めて、RINは急速に減少するがRNA IQは時間経過とともにほぼ安定しており、不一致を示しています。（C）RT-qPCRの結果も経時的に安定しており、RNA IQと一致しましたが、RINとは一致しませんでした。

複雑なタンパク質混合物からタンパク質負荷量を正確に決定。Qubit Protein BR Assayおよび標準のBradfordアッセイを使用して、複数の哺乳類細胞タイプからのライセートのタンパク質濃度を測定しました：293T、A549、HepG2、HeLa、およびiPSC。ライセートはInvitrogen NuPAGE 4～12% Bis-Tris Mini Protein Gelで分離し、No-Stain Protein Labeling Reagentで標識しました。（A）ゲル画像はiBright FL1500 Imaging Systemで取得し、（B）正規化係数はInvitrogen iBright Analysis Softwareを使用して決定しました。Qubit Protein BR Assayの変動係数（CV）はBradfordアッセイよりも明らかに低くなりました。