免疫チェックポイント抗体

T 細胞活性化は、活性化T細胞上に、抗原提示細胞（APC）からの抑制性シグナルを媒介するPD-1（別名：PDCD-1）などの受容体が発現するように、通常、自己限定的です。PD-1 は、2 種類の関連するリガンド、PD-L1 および PD-L2 に結合します。PD-1 がこれらのいずれかのリガンドに結合すると、PD-1 によって生じたシグナルが TCR 媒介性増殖およびサイトカイン産生を低下させます。PDL-1 発現の増加は、多くのマウスおよびヒトのがんに関連し、さらに IFN-γ の刺激によって上方制御され得ますそのため、PD-L1 は腫瘍による免疫回避において重要な役割を果たしていると考えられます。

DR3／TNFRSF25 は、TNF 受容体スーパーファミリーのメンバーです。この受容体は、リンパ球が豊富な組織において高発現し、リンパ球の恒常性維持の調節に重要な役割を担っていると考えられます。DR3 のリガンドとして唯一知られているのは、TNF スーパーファミリーのメンバーである TL1A（TNF様サイトカイン 1A, TNFSF15）です。この受容体のシグナル伝達は、さまざまなデスドメイン含有アダプタータンパク質によって媒介されます。マウスにおけるノックアウト研究では、DR3／TNFRSF25が胸腺における自己反応性T細胞の除去に役割を果たしていることが示唆されています。また、研究では、関節リウマチ（RA）、コラーゲン関節炎（CIA）、および炎症性腸疾患（IBD）などのさまざまなヒト疾患や動物疾患モデルにおいて、TL1A および DR3 の関与が示唆されています。

DR3／TNFRSF25 の免疫蛍光分析。実験は固定および透過処理した Ramos 細胞上で実施し、内在性 DR3／TNFRSF25 の検出に ABfinity Anti-DR3／TNFRSF25 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody（製品番号 702277、2 µg/mL）を使用し、Goat Anti–Rabbit IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate（製品番号 A27034、1：2,000）で標識しました。パネル a は DR3/TNFRSF25 タンパク質（緑色）の検出および局在性確認用に染色した個々の細胞、パネル b は SlowFade Gold Antifade Mountant with DAPI（製品番号 S36938）で染色した核（青色）、パネル c は Alexa Fluor 555 Rhodamine Phalloidin（製品番号 R415、1：300）で染色した細胞骨格 F-アクチン、パネル d は、パネル a、b、および c の重ね合わせ画像で、膜内の DR3／TNFRSF25 の局在が明確に示されています。画像は、60 倍の倍率で撮影しました。

T 細胞免疫グロブリンムチン-3（TIM-3）は、多くのタイプのヒト急性骨髄性白血病（AML）におけるヒト骨髄性白血病幹細胞の細胞表面に発現しますが、造血幹細胞（HSC）上には発現しません。TIM-3 はホジキン病組織で過剰発現しますが、ホジキンおよびリード・シュテルンベルク（H＆RS）細胞と周囲の細胞との相互作用に関与しているとされます。ガレクチンは β–ガラクトシド結合タンパク質のファミリーで、細胞–細胞間および細胞–マトリックス間の相互作用の調節に関与しています。ガレクチン-9（Gal-9）は TIM-3 のリガンドで、これらのタンパク質はともに白血病幹細胞（LSC）の自己複製とヒト AML の発症に極めて重要な自己分泌ループを構成していることから、この疾患の発病および／または関連する免疫不全に関与していると考えられます。 

                                         ガレクチン-9

CTLA4 は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーで、T 細胞に対する抑制性シグナルを伝達するタンパク質をコードします。この遺伝子における変異は、インスリン依存性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、セリアック病、全身性エリテマトーデス、甲状腺関連眼窩疾患、および他の自己免疫疾患に関連します。CD80（B7-1）および CD86（B7-2）は、T 細胞上の重要な共刺激分子CD28 や抑制性受容体 CTLA-4（CD152）に結合するリガンドです。いずれの B7 分子もプロフェッショナル抗原提示細胞上で発現するもので、T 細胞活性化に不可欠です。CD80 と CD86 の能力差については完全に解明されてません。そのため、既存の試験結果において、これらのリガンドそれぞれの役割について T 細胞免疫反応を開始する、あるいは維持するかで対立しています。

CTLA-4 の免疫細胞化学。PMA およびイオノマイシンカルシウムで処理し浸漬固定したヒト末梢血単核球細胞を Goat Anti–Human CTLA-4 Antigen Affinity-Purified Polyclonal Antibody（製品番号 Pa5-47547））15 µg/mL 用いて室温で 3 時間処理し、ターゲットを検出しました。細胞は蛍光色素標識 抗ヤギ IgG 二次抗体（赤色）で染色し、DAPI（青色）で対比染色しました。細胞表面に対し局所的に特異的染色しました。

TIGIT は、近年同定された共抑制受容体で、さまざまなリンパ球系細胞、特に Foxp3+制御性 T 細胞の表面に発現します。TIGIT の発現量は、腫瘍浸潤性 T 細胞上で著しく高いです。ポリオウイルス受容体（PVR、CD155）は、3つの Ig ドメイン（V-C-Cの配列）を持つ Ig スーパーファミリーのメンバーで、TIGIT に対する高親和性受容体です。TIGIT がその受容体 CD155 に結合すると、IL-10 分泌の増加と IL-12B 分泌の減少が生じ、成熟した免疫調節樹状細胞の産生が促進されることにより T 細胞活性化が抑制されます。

HeLa 細胞膜染色によるCD155（緑色）の免疫蛍光分析。ホルマリン固定した細胞を TBS で希釈した 0.1％ Triton X-100 で 5 ～ 10 分間透過処理し、3％ BSA-PBS を用いて室温で 30 分間ブロッキングしました。細胞は、3％ BSA-PBS で 1：20 で希釈した CD155 monoclonal antibody（製品番号 MA5-13493）で、4 °C で一晩、加湿チャンバーにてインキュベーションし、プローブしました。細胞は PBST で洗浄後、PBS 中の DyLight 標識二次抗体とともに、暗所下、室温でインキュベーションしました。F-アクチンはファロイジン（赤色）、核は Hoechst または DAPI（青色）で染色しました。画像は、60 倍の倍率で撮影しました。

LAG3（CD223）は、活性化 T 細胞、NK 細胞、B 細胞、および形質細胞様樹状細胞の細胞上で発現される細胞表面分子です。LAG3 は、その主要なリガンドである Class II MHC と結合することで、樹状細胞の機能を調節する役割を担います。調査研究では、LAG3 が、複数の移植性腫瘍における腫瘍浸潤性 CD4+ および CD8+ T 細胞の表面にも広範囲に PD-1 とともに共発現することが認められています。

ヒト PBMC のフローサイトメトリー解析。未処理（A）または（B）1 µg/mL PHA で 5 日間処理した細胞を Goat Anti–Human LAG-3 Antigen Affinity-Purified Polyclonal Antibody（製品番号 PA5-47298）に続いて、APC 標識抗ヤギ IgG 二次抗体および PE 標識マウス抗ヒト CD3ε モノクローナル抗体で染色しました。四分画マーカーは、コントロール抗体染色に基づいてセットしました。