エピジェネティック抗体

H3K9me2 抗体は、Lys9 のジメチル化を特異的に認識。ジメチルヒストン H3 Lys9（ヒストン H3K9me2）に対する特異性を示す交差反応 ELISA を、ヒストン H3K9me2 Abfinity™ 組換えウサギモノクローナル抗体（製品番号 701783）を使用して行いました。抗原（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、およびH3K9 Nme）は 0.004 µg/mL でコーティングしました。抗体は 10、2.5、0.625、および0.156 µg/mL で添加し、ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、HRP コンジュゲート（製品番号 G-21234、希釈 1:5,000）を使用して信号を検出しました。プレートは、Stabilized Chromogen、TMB（製品番号 Sb02）を用いて発色させ、488 nm の吸光度を検出しました。

優れたペプチド特異性を用いたヒストン H3K4me1 検出。ペプチドアレイは、ABfinity™ 組換えウサギオリゴクローナル抗体（製品番号 710795）および H3K4me1 をターゲットとする 2 種類の他社抗体を用いて行いました。アレイは、1:2,000 希釈した一次抗体とともに一晩インキュベーションしました。洗浄後、それらのアレイを 1:5,000 で希釈したヤギ抗ウサギ IgG (H+L) Superclonal™ 二次抗体（製品番号 A27036）で 1 時間インキュベーションしました。アレイは、 SuperSignal™ West Pico substrate（製品番号 34078）とともにインキュベーションした後、myECL™ Imager（製品番号 62236）を用いて可視化しました。

H3K4me1 オリゴクローナル抗体（製品番号 710795 を用いた、PFI-2 処理した細胞における H3K4me1 減少の同定。HeLa 細胞は、図に示しているように、さまざまな濃度の SETD7 阻害剤 (PFI-2) で2時間処理しました。細胞を回収し、クロマチン-結合核抽出物を調製しました。H3K4me1 のウェスタンブロット解析（上のパネル）は、還元サンプルバッファー（製品番号 39000）中の 10 µg の酸クロマチン-結合核抽出物とタンパク質ラダー（製品番号 26619）を 4–20% Tris-glycine polyacrylamide gel（製品番号 WT4201BX10）にロードし実施しました。タンパク質は、セミドライ式ブロッタ（製品番号 6228）を使用し、Pierce™ 1-Step Transfer Buffer（製品番号 84731）でニトロセルロースメンブレン（製品番号 88018）に転写しました。メンブレンは、StartingBlock™ T20（製品番号 37543）にて、室温で 30 分、ブロッキングしました。

パラフィン包埋したマウス脳組織（右）の核における CBX5 の免疫組織化学染色の、一次抗体不使用の陰性対照（左）との比較。標的タンパク質を露出させるため、10 mM のクエン酸ナトリウム（pH 6.0）を使用し、電子レンジで 8 ～ 15 分加熱して抗原を回復しました。抗原回復後、組織を 3 ％ H₂O₂-メタノール中で 15 分間室温でブロッキングし、ddH₂O および PBS で洗浄した後、3％ BSA-PBS で 1:100 で希釈した CBX5 モノクローナル抗体（製品番号 730019）で 4 °C で一晩、加湿チャンバーにてプローブしました。組織を PBST でしっかり洗浄し、HRP 標識二次抗体に続いて、DAB キットを使用し比色検出しました。組織は、ヘマトキシリンで対比染色し、エタノール脱水およびキシレン処理を行い、マウント用に調製しました。

70% コンフルエントの対数期の MCF-7 細胞における PRMT5 の免疫蛍光分析。細胞は、4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定し、0.1% Triton™ X-100 で 10 分間透過処理した後、1% BSA で室温で1時間ブロッキングしました。細胞は、2 µg/mL の 0.1％ BSA で PRMT5 マウスモノクローナル抗体（製品番号 730054）で標識し、室温で 3 時間インキュベーションした後、1:2,000 で希釈したヤギ抗マウス IgG (H+L) Superclonal™ 二次抗体、Alexa Fluor™ 488コンジュゲート（製品No. A28175）で室温で 45 分間標識しました（緑色、パネル A）。核（青色、パネルB）は、SlowFade™ Gold Antifade Mountant with DAPI（製品番号 S36938）で染色しました。F-アクチン（赤色、パネルC）は、 Alexa Fluor™ 555 Rhodamine Phalloidin（製品番号 R415, 1:300 希釈）で染色しました。パネル D は、細胞質内局在の重ね合わせ画像です。パネル E は、一次抗体不使用のコントロールです。画像は、60 倍の倍率で撮影しました。

HDAC3 のクロマチン免疫沈降解析実験は、0、15、30 分間血清で処理した 1 x 10⁶ 個の HCT116 結腸がん細胞由来の架橋クロマチンを用いて実施しました。免疫沈降は、マルチプレックスマイクロプレート Matrix ChIP アッセイ（Matrix ChIP プロトコル参照： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22098709）を、100 µL のウェルボリュームあたり 1.0µL の HDAC3 ポリクローナル抗体（製品番号 PA1-862）で行いました。ChIP プルダウンにつき ~ 1 x 10⁵ 個の細胞からのクロマチン分割量が使用されました。定量 PCR データは、Egr1 遺伝子ならびに、Egr1 のエクソン 1 およびエクソン 2 の 15 kb 上流を増幅させるためのプライマーを用いた、2 µL の SYBR リアルタイム PCR 反応における 1 µL の溶出 DNA を用いて、4 通り取得しました。剪断した全ゲノム DNA の希釈系列を用いて、各プライマーペア用のPCR 検量線を作成しました。免疫沈降したクロマチンの定量は、インプットクロマチンの全量に対し相対的なシグナルとして示されます。3 つの実験の結果を平均 ± SEM で表しています。Egr-1 遺伝子座の模式図を左上に示しました。ここで、ボックスはエクソン（ブラックボックス = 翻訳領域、ホワイトボックス = 非翻訳領域）、波線はイントロンを示し、直線は上流配列を示します。Egr-1 プライマーによって増幅された領域は、黒線で示されています。データ提供: Antibody Data Exchange Program。

ポリコーム抑制複合体（PRC1 および PRC2）の機能

抗ヒストン H2A-Ub ウサギポリクローナル抗体を用いた、内在性ヒストン H2A-Ub タンパク質の濃縮クロマチン免疫沈降（ChIP）は、抗ヒストン H2A-Ub ウサギポリクローナル抗体（製品番号 720148、3 µg）を 2 x 10⁶ 個の HeLa 細胞の剪断したクロマチンに対し、MAGnify™ クロマチン免疫沈降システム（製品番号 49-2024）を用いて実施しました。正常ウサギ IgG（1 µg）をネガティブ IP コントロールとして使用しました。精製 DNA は Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (製品番号 4351106) を用いて、ポジティブコントロールターゲットとして用いた不活性な SAT2 サテライト反復領域用に最適化された PCR プライマーペアと、陰性対照ターゲットとしての活性のある cFOS（FOS）β-アクチン（ACTB）領域のプロモーターを使用して解析しました。比較 C_t 法を用いて陰性対照 IgG と比較した抗体シグナルの fold enrichment として結果を示しています。

HCT 116 細胞上の EZH2 のフローサイトメトリー解析。細胞は、70% エタノールで 10 分固定し、0.25％ Triton™ X-100 で 20 分透過処理した後、5％ BSA で室温で 30 分間ブロッキングしました。細胞は、EZH2 ウサギポリクローナル抗体（製品番号 36-6300、赤いヒストグラム）またはウサギ同位体コントロール（ピンクのヒストグラム）を使って 2.5％ BSA 中の 10⁶ 個の細胞当たり 3 ～ 5 µg で標識されました。室温で 2 時間インキュベーションした後、細胞を 1:400 で希釈したヤギ抗ウサギ二次抗体、Alexa Fluor™ 488コンジュゲート（製品番号 A-11008）と室温で 30 分間標識しました。代表的な10,000 細胞を取得し、各サンプルを Applied Biosystems™ Attune™ Acoustic Focusing Cytometer を用いて解析しました。紫色のヒストグラムは未染色のコントロール細胞、緑色のヒストグラムは一次抗体処理なしのコントロールを示しています。

NF-κ-B（p65）のウェスタンブロット解析本実験は、20 µg の HeLa、A549、A431、K562、Jurkat、HEK-293、および MDA-MB-231 細胞ライセートを、XCell SureLock™ 電気泳動装置（製品番号 EI0002）を用いて、NuPAGE™ 4–12 % Bis-Tris gel（製品番号 NP0321BOX）上で Novex™ Sharp Pre-stained タンパク質基準（製品番号 LC5800）とともにランし、iBlot™ Dry Blotting System（製品番号 IB21001）を用いて、タンパク質をブロットすることにより、実施しました。タンパク質はニトロセルロースメンブレンに転写し、5%スキムミルクで室温で1時間、ブロッキングしました。NF-kappa-B（p65）は、NF-kappa-B（p65）マウスオリゴクローナル抗体（製品番号 710048）を用いて、ロッキングプラットフォーム上で 4 °Cで一晩、0.5 ～1 µg/mL の 2.5％スキムミルクを使用して約 65 kDa で検出されました。1:5,000 で希釈したヤギ抗ウサギ IgG HRP 二次抗体（製品番号 G-21234）を使用し、Novex™ ECL 化学発光基板試薬キット（製品番号 WP20005）を用いて化学発光検出を実施しました。ブロットは、β-チューブリン（製品番号 32-2600）で再プローブしました。

特異的抗体を用いたNF-κ-B（p65）のChIP-qPCR 解析本実験は、3 µg/mL の NF-kappa-B p65 Abfinity™ オリゴクローナル抗体（製品番号 710048）を TNF-alpha（50 ng/mL で 1 時間）で処理した 2 x 10⁶ 個の HeLa 細胞の剪断したクロマチンに対し、MAGnify™ クロマチン免疫沈降システ（製品番号 49-2024）を用いて実施しました。正常ウサギ IgG（3 µg/mL）をネガティブ IP コントロールとして使用しました。各 ChIP サンプルから精製したDNA を、Applied Biosystems™ StepOnePlus™ Real-Time PCR System（製品番号 4376600）を用い、ポジティブコントロールターゲットとして用いた IL-8 および IL-6 遺伝子、ならびに陰性対照ターゲットとしての GAPDH 遺伝子のプロモーター用プライマーを使用して解析しました。 比較 C_t 法を用いて陰性対照 IgG と比較した抗体シグナルの fold enrichment として結果を示しています。

HeLa 細胞への siRNA 導入後に SMAD2 発現を検出。細胞には、50 nM Silencer™ SMAD2 siRNA（製品番号 115714）（レーン 3）、または 50 nM Silencer™ Negative Control siRNA（レーン 2）を導入するか、導入しないまま（レーン 1）としました。その後、細胞ライセート由来のタンパク質をゲル電気泳動により分離後、メンブレンに転写し、SMAD2 Abfinity™ モノクローナル抗体（製品番号700048、0.5 µg/mL）およびヤギ抗ウサギ IgG (H+L) Superclonal™ 二次抗体、HRP コンジュゲート（製品番号 A27034、0.4 µg/mL、希釈 1:2,500）を使用してウェスタンブロットで検出されました。ブロットは、ローディングコントロールとしてアクチン抗体（製品番号 PA5-16914）で再プローブしました。アクチンに対して標準化したバンドの相対密度から、SMAD2 発現のサイレンシングおよび　ABfinity™ 抗体の特異性を確認します。