細胞内pHは一般的には、細胞質中では約6.8~7.4の範囲にあり、細胞の酸性オルガネラにおいては約4.5~6.0の範囲にあります。細胞内遊離Ca2+ 濃度が迅速に約100倍変化する可能性があるのとは異なり、細胞内pHの変動はごくわずかであり、その変化は極めてゆっくりと起こります。

Molecular Probes®では、 細胞質または特定の細胞小器官における細胞内pHをトラッキングするための、幅広い種類のpH インジケーターをご提供しています。 色素コンジュゲートは細胞小器官をターゲットとしたものも入手可能で、さらに特定のアプリケーション用の独自の蛍光プローブを構築するための反応性色素もご用意しています。

pHインジケーターを選択する

細胞質pHトラッキング用インジケーター

  • マルチプレックス解析用の赤色および緑色色素
  • レシオメトリックベースの測定または強度ベースの測定の選択肢

蛍光強度またはレシオメトリックの測定のいずれを使用しても、高感度のpH 決定を生理学的な範囲で実行することが可能です。BCECFおよびそのAMエステルは、狭いpH範囲内におけるレシオメトリック測定に使用することが可能で、pHrodo™色素はpH 2~pH 9において、様々な蛍光波長におけるシグナル強度変化を確認することが可能です。

pHrodo™ Green AM Intracellular pH Indicatorでラベル化したU2OS 細胞。 U2OS 細胞は10 µMの pHrodo™ Green AM Intracellular pH Indicator と共に、室温において30分間インキュベーションした。画像は共焦点顕微鏡を使用して取得した。

キャリブレーションおよび測定

pHrodo™ AM variety packでは、pH測定のために赤色または緑色インジケーターを選択することが可能です。細胞内pH キャリブレーションバッファーキットと共に使用することにより、pHrodo™ 色素は生細胞における、洗浄を必要としない、完全なソリューションを提供します。

BCECF(左)およびpHrodo® 赤色(右)色素を使用した 細胞内pH測定。pHrodo™色素は、中性pHにおいては基本的に非蛍光性であり、極めて光安定性が高いため、再現性のある測定が可能となる。これらの試薬はpH 2 ~ pH 9において、様々な蛍光波長におけるシグナル強度変化を確認することが可能。

小胞内pHのトラッキング

蛍光デキストランの内部移行のトラッキングは、細胞内コンパートメントにおけるpH変化を解析するためにルーチンに使用されている方法です。pHrodo™ 色素のデキストランコンジュゲートは、最も完全なソリューションを提供し、消光または洗浄を必要とせずに、初期エンドソームからリソソームまでの小胞の識別を可能とします。

pHrodo™ 色素は、中性pHにおいては基本的に非蛍光性であり、pH 2 ~ pH 9において、様々な蛍光波長におけるシグナル強度変化を確認することが可能です。pHrodo™ RedをRhodamine Green™と共に平均分子量 10,000 のデキストランへコンジュゲートすることにより、トラッキングのためのリファレンスシグナルとして二重ラベル化されたプローブも提供します。

pH 変化を使用してMMM細胞における食作用をモニターするために、 pHrodo™ GreenE. coliBioParticles® コンジュゲートを使用しています.

pH インジケーター選択ガイド

 ppHrodo™ Green AM Intracellular pH Indicator pHrodo™ red AM Intracellular pH indicator2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester(BCECF、AM)
リードアウトpHrodo 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。色素を約490 nmおよび約440 nmで 励起した場合の、pH-依存性の発光強度比(535 nmにおいて検出)。
範囲pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲は6.2 ~9.5
標準的なフィルターセット
FITC
TRITCpHの定量のために、励起比が必要となります
蛍光色素pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色BCECF
励起/発光(mn)509/533560/585~440-490/535
細胞透過性または非透過?透過性透過性透過性
使用の注意培地中でのローディング
プラットフォームフローサイトメーター、マイクロプレートリーダー、イメージングマイクロプレートリーダー
フォーマット50 µL の5 mM溶液 (1,000x)50 µL の5 mM 溶液(1,000x)20 x 50 µg
カタログ番号P35373P35372B1170
 pHrodo™ (AM) バラエティーパック細胞内pH キャリブレーションキット
リードアウトpHrodo™ 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。pHrodo™ Red AM およびpHrodo™ Green AMを使用して生細胞内の正確なpHが測定できます。
範囲pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲は4.5 ~7.5
標準的なフィルターセットFITCTRITC
細胞膜孔を作成するためのValinomycinおよびnigericin
蛍光色素pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色
励起/発光(mn)509/533560/585
細胞透過性または非透過性?透過性透過性細胞膜を透過化する
使用の注意培地中でローディング細胞 pH が培地と平衡化
プラットフォームフローサイトメーター、マイクロプレートリーダー、イメージング
フォーマット1 キット1 キット
カタログ番号P35380P35379
 pHrodo™ Greenデキストラン、平均分子量10,000 pHrodo™ Redデキストラン、平均分子量10,000 デキストラン、 BCECF、平均分子量10,000、陰イオン性
リードアウト pHrodo™ 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。色素を約490 nmおよび約440 nmで 励起した場合の、pH-依存性の発光強度比(535 nmにおいて検出)。
範囲 pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲 6.2 ~9.5
小胞 デキストラン、分子量 10,000デキストラン、分子量 10,000デキストラン、分子量 10,000
標準的なフィルターセット FITCTRITCpHの定量のために、励起比が必要となります
フルオロフォア pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色BCECF
励起/発光 (nm) 509/533560/585~440-490/535
細胞 透過性または非透過性? 非透過性非透過性非透過性
使用の注意エンドサイトーシス、マイクロインジェクション、飲作用細胞ローディング試薬のパッチピペットによるローディングエンドサイトーシス、マイクロインジェクション、パッチピペットまたは飲作用細胞ローディング試薬によるローディング
プラットフォーム フローサイトメーター、マイクロプレート、イメージングイメージング
フォーマット 0.5 mg0.5 mg10 mg
カタログ 番号P35368P10361D1878
 ppHrodo™ Green AM Intracellular pH Indicator pHrodo™ red AM Intracellular pH indicator2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester(BCECF、AM)
リードアウトpHrodo 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。色素を約490 nmおよび約440 nmで 励起した場合の、pH-依存性の発光強度比(535 nmにおいて検出)。
範囲pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲は6.2 ~9.5
標準的なフィルターセット
FITC
TRITCpHの定量のために、励起比が必要となります
蛍光色素pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色BCECF
励起/発光(mn)509/533560/585~440-490/535
細胞透過性または非透過?透過性透過性透過性
使用の注意培地中でのローディング
プラットフォームフローサイトメーター、マイクロプレートリーダー、イメージングマイクロプレートリーダー
フォーマット50 µL の5 mM溶液 (1,000x)50 µL の5 mM 溶液(1,000x)20 x 50 µg
カタログ番号P35373P35372B1170
 pHrodo™ (AM) バラエティーパック細胞内pH キャリブレーションキット
リードアウトpHrodo™ 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。pHrodo™ Red AM およびpHrodo™ Green AMを使用して生細胞内の正確なpHが測定できます。
範囲pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲は4.5 ~7.5
標準的なフィルターセットFITCTRITC
細胞膜孔を作成するためのValinomycinおよびnigericin
蛍光色素pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色
励起/発光(mn)509/533560/585
細胞透過性または非透過性?透過性透過性細胞膜を透過化する
使用の注意培地中でローディング細胞 pH が培地と平衡化
プラットフォームフローサイトメーター、マイクロプレートリーダー、イメージング
フォーマット1 キット1 キット
カタログ番号P35380P35379
 pHrodo™ Greenデキストラン、平均分子量10,000 pHrodo™ Redデキストラン、平均分子量10,000 デキストラン、 BCECF、平均分子量10,000、陰イオン性
リードアウト pHrodo™ 色素は中性pHにおいては非蛍光性であり、酸性化により蛍光発光強度が増大します。色素を約490 nmおよび約440 nmで 励起した場合の、pH-依存性の発光強度比(535 nmにおいて検出)。
範囲 pH 8 ~ pH 4で蛍光強度が増大します。pH 範囲 6.2 ~9.5
小胞 デキストラン、分子量 10,000デキストラン、分子量 10,000デキストラン、分子量 10,000
標準的なフィルターセット FITCTRITCpHの定量のために、励起比が必要となります
フルオロフォア pHrodo™ 緑色pHrodo™ 赤色BCECF
励起/発光 (nm) 509/533560/585~440-490/535
細胞 透過性または非透過性? 非透過性非透過性非透過性
使用の注意エンドサイトーシス、マイクロインジェクション、飲作用細胞ローディング試薬のパッチピペットによるローディングエンドサイトーシス、マイクロインジェクション、パッチピペットまたは飲作用細胞ローディング試薬によるローディング
プラットフォーム フローサイトメーター、マイクロプレート、イメージングイメージング
フォーマット 0.5 mg0.5 mg10 mg
カタログ 番号P35368P10361D1878

pHrodo™ インジケーターとは?

pHrodo™ 色素 はその周囲の pH がより酸性化することで劇的に蛍光を増加させる新規の蛍光色素です。pHrodo™ Green色素およびそのコンジュゲートの最適な吸光および最大蛍光発光はそれぞれ509 nm および533 nmであり、 pHrodo™ Redは560 nmで励起し585 nmで発光します。pHrodo™ GreenおよびpHrodo™ Redはいずれも、多くのフローサイトメーター、顕微鏡およびマイクロプレートリーダー上に装着されている、488 nmのアルゴンイオンレーザーによっても励起することが可能です。

pHrodo™ Red(左)およびpHrodo™ Green(右)色素の蛍光発光スペクトル。

 

 

pHrodo™ red and pHrodo™ Green dye fluorescence emission spectra

pHrodo™ Red(左)およびpHrodo™ Green(右)色素の蛍光発光スペクトル。pHrodo™ 色素標識済み E. coli の蛍光スペクトルを、pH 4~10 の範囲の50 mM の リン酸カリウム バッファー中で測定した。E. coli の濃度は0.1 mg/mLで、、読み取りは 日立F4500 フルオロメーター上で励起波長 532 nm を使用して行わた。

 

マウスJ774A.1マクロファージをpHrodo™ Green AM 細胞内pH インジケーターおよびpHrodo™ Red(10,000 MW Dextran)で標識した。pHi は、 細胞内 pH キャリブレーションバッファーキットを使用して指定の値に固定した。