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Click-iT® Plus EdU細胞増殖アッセイは、クリックケミストリーを利用して新生DNAの検出および定量を行う手法であり、従来のBrdU法の優れた代替法です。 DNA合成中に修飾された核酸であるEdU(5-エチニル-2′-デオキシウリジン)が取り込まれ、「クリックケミストリー」反応によって迅速に検出されます。また、サンプルへの影響は最小限にとどまります。 |
Click-iT® Plus EdU—クリックケミストリーのシンプルさは、BrdUに替わるより速くて使いやすい手法を生み出します。ブロモデオキシウリジン(BrdU)を使ったアッセイとは違い、Click-iT® EdU アッセイは、抗体ベースではないので、DNA 変性処理は不要です。加えて、利便性をさらに増すために、R-PE、R-PEタンデムおよびGFPといった蛍光タンパク質とマルチプレックス解析が可能となりました。
新しい Click-iT® Plus EdUテクノロジーには以下のような特長があります:
2つの手法を並べて比較すると、Click-iT® Plus EdUの優位性が良く分かります。(表 1).
Click-iT® Plus EdU | BrdU | |
---|---|---|
ベーシックな実験に必要な試薬 | ||
ステップ数 | 6 (複数回の透過処理不要、 DNase処理不要) | ~10 |
結果が出るまでの時間 (ラベリング+検出) | 通常 <90 min | 5時間からオーバーナイト |
DNA変性 | なし | 必須 |
マルチプレックス化への対応 | Yes | Yes |
Click-iT® Plus EdUの長所はその化学的性質にあります—低分子で、特異的かつ低バックグラウンドの標識パーツと検出パーツが互いに特異的かつ共有結合的に反応します。5-エチニル-2´-デオキシウリジン(EdU)はアルキンを含むヌクレオシド アナログです。銅触媒反応において、アルキンは色素標識ピコリルアジドと反応し、安定な共有結合を形成します。サイズの小さいアジ化化合物は、細胞に強い処理を行わなくてもDNAに効率良くアクセスできます。これによりアッセイは大幅に単純化され、BrdUを用いて通常得られる結果と同等以上の結果を得ることができます。(図1および2)。
図1.Alexa Fluor® 647 Click-iT® Plus EdUによる標識と緑色蛍光タンパク質(GFP)およびFxCycle™ Violet染色。GFP-発現A375(ヒト悪性黒色腫細胞)を10 µM EdUで2時間処理し、推奨染色プロトコールに従って検出を行った。 Panel A はAlexa Fluor® 647 picolyl azideで標識された細胞のヒストグラムを示しており、S期の細胞を同定している。Panel B はClick-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 647 picolyl azide存在下(黒色のライン)および銅非存在下(灰色のライン)におけるGFP-発現のヒストグラムを重ね合わせたもので、クリック反応中にGFP蛍光が保持されることを示す。Panel C はClick-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 647およびDNA量解析用FxCycle™ Violet染色の2パラメータプロットを示しており、二重陽性の細胞はS期にあることを示す。 |
図2.Alexa Fluor® 488 Click-iT® Plus EdU標識と mCherry蛍光タンパク質およびFxCycle™ Far Red染色。mCherry-発現A549 細胞を10 µM EdUで2 時間処理し、推奨染色プロトコールに従って検出を行った。Panel A はAlexa Fluor® 488 picolyl azideで標識した細胞のヒストグラムを示しており、S期の細胞を同定している。Panels Bおよび C はClick-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 488 picolyl azideで標識した細胞の銅存在下(Panel B)および非存在下(Panel C)におけるmCherry 蛍光を示しており、クリック反応中にmCherry蛍光が保持されることを示す。Panel D はClick-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 488およびDNA量解析用FxCycle™ Far Red染色の2パラメータプロットを示しており、二重陽性の細胞はS期にあることを示す。 |
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