フローサイトメトリー用の固定不可の生存率解析用試薬

細胞非透過性SYTOX® DNA結合試薬を用いた生存率アッセイ

SYTOX® Dead Cell染色試薬は、正常な細胞膜を透過せず、dsDNAに結合すると強い蛍光を示すため、弊社の最も鮮やかな死細胞染色試薬となっています（図1）。使いやすいSYTOX®死細胞染色試薬は、水溶性培地中では非蛍光性であるため、追加の洗浄ステップなしで細胞に添加するだけで可視化することができます。これらの色素は、多くの単一カラーフォーマットにて利用可能であり、多くのレーザーと適合しているため、お客様が必要とする柔軟性をもたらします。また、こうした染色試薬は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、およびマイクロプレートなど複数のプラットフォームで使用することができます。

細胞非透過性SYTOX® DNA結合色素の選択ガイド

図 1. SYTOX® Dead Cell染色試薬を透過させない生細胞 熱処理済みおよび無処理のヒト末梢血白血球の混合物を、Alexa Fluor® 488標識抗ヒトCD3抗体、R-PE標識抗ヒトCD8抗体、および5 nMのSYTOX® Red Dead CellStainで染色した後、フローサイトメトリーを使用して励起波長488 nmおよび635 nmで解析しました。 (A) 2種の細胞集団の蛍光強度分布を示すヒストグラム--死細胞は強いSYTOX® Redの蛍光シグナルを示していますが、生細胞は示していません。 (B)生細胞にゲートオンした後のCD8およびCD3染色のデュアルパラメータープロット。

従来の細胞非透過性DNA結合色素を用いた生存率アッセイ

細胞非透過性の従来のDNA結合色素には、propidium iodideおよび7-AADなどがあります（図2）。これら色素のいずれもが、488または532 nmのレーザーで励起されて610 nm超の蛍光を発するため、フローサイトメトリーでの生存率アッセイに広く使用されてきました。

従来の細胞非透過性DNA結合色素の選択ガイド

図 2. propidium iodideを用いた死細胞染色。 Jurkat細胞を、10 μMのカンプトテシンで4時間処理した後、 Alexa Fluor® 488標識Annexin V & propidium iodideが入っている死細胞アポトーシスキットを用いて染色しました。 細胞は、フローサイトメトリーを用いて励起波長488 nmで解析し、530/30と575/24のバンドパスフィルターを装着したAttune® Acoustic Focusing Cytometerにて、標準的な100 μL/minのflow rateで回収しました。 死（壊死）細胞では、アポトーシス細胞や生細胞に比べ、強いpropidium iodide染色が示されました。 A=アポトーシス細胞、V = 生細胞、N = 壊死細胞。

エステラーゼ基質を用いた生存率アッセイ

CellTrace™カルセインAM色素は、接着細胞および非接着細胞内に受動的にロードすることができます。こうした細胞透過性エステラーゼ基質は、蛍光の活性化に必要な酵素活性、およびそれら蛍光産物の細胞内保持に必要な細胞膜完全性を測定する生存率プローブとして役に立ちます。青色、紫色、および緑色の蛍光として利用可能なこれらの色素は、生細胞の短期間染色に理想的であり、マルチプレックス化したフローサイトメトリー実験で使用することができます（図3）。

エステラーゼ基質の選択ガイド

図 3. 生細胞のCellTrace™ Calcein Green AM染色。 ヒトB細胞とエタノール固定した（死んだ）ヒトB細胞の1：1混合物を、calcein green AMおよびethidium homodimer-1で染色しました。 5分後、フローサイトメトリー解析を励起波長488 nmで行いました。 得られた二変量の度数分布は、緑色蛍光（530 nm）の生細胞集団が、赤色蛍光（585 nm）の死細胞集団から明瞭に分離していることを示しています。

エステラーゼ基質およびアミン反応性色素を用いた生存率アッセイ

LIVE/DEAD® Violet Viability/Vitalityキット

LIVE/DEAD® Violet Viability/Vitalityキットを使用すれば、細胞の健康状態の有効なパラメーターを測定する2種のプローブによる生細胞および死細胞の同時測定を基にした、2色蛍光での細胞生存率および活力アッセイを行うことができます。これらパラメーターは、細胞生存率の指標としての原形質膜の完全性、および細胞活性の指標としての細胞内エステラーゼ活性です（図4）。CellTrace™ Calcein Violet AMおよびLIVE/DEAD® Fixable Aqua fluorescent reactive色素は、このアプリケーションに最適です。いずれの色素もバイオレットレーザーを利用しているため、他のレーザーをより一般的なマーカー用に使用することが可能になります。

IVE/DEAD® Viability/Vitalityキットの詳細をご覧ください

図 4. 加熱により死滅させた細胞と無処理のJurkat細胞の混合物の染色。 Jurkat細胞は、LIVE/DEAD® Violet Viability/Vitalityキットのプロトコルに従って染色されました。 calcein violetで標識した生細胞(L)は450/50 nmのバンドパスフィルターを使用し、auqa-dyeで標識された死細胞 (D)は525/50 nmバンドパスフィルターを使用して、405 nmレーザーを備えたフローサイトメーターで細胞を解析しました。