超高感度レポーター遺伝子アッセイ

NovaBright™ レポーター遺伝子アッセイでは、比色法または蛍光検出よりも高感度な、化学発光によるレポーター遺伝子活性の測定ができます。NovaBright™ キットは、ほとんどの一般的なレポーター遺伝子に利用でき、フェムトグラムからナノグラム レベルまでのレポーターの広いダイナミックレンジにわたった高感度性で、一貫した結果を得られるように最適化されています。

  • 高感度性
  • 広いダイナミックレンジ
  • 使いやすい3種類のフォーマット
   

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レポーター遺伝子アッセイ

遺伝子発現調節の解析
レポーター遺伝子アッセイは、シス作用性因子（遺伝子調節エレメント）またはトランス作用性因子（転写因子または外因性調節）による遺伝子発現調節の解析に非常に有用です。レポーター遺伝子アッセイでは、研究対象である遺伝子のコーディング領域をレポーター遺伝子が代理します。

レポーター遺伝子コンストラクトには、解析対称となる遺伝子調節エレメント、レポーター遺伝子の構造配列、および機能性mRNAを合成するために必要な配列が含まれています。レポーターコンストラクトを細胞に導入すると、レポータータンパク質の酵素活性のダイレクトアッセイによってレポーター遺伝子の発現レベルをモニターできます。

超高感度性
各レポーター遺伝子アッセイの感度は、検出方法、レポーターmRNAおよびタンパク質の代謝回転、レポーター活性の内因性（バックグラウンド）レベルなど、複数の要因によって異なります。タンパク質の代謝回転と内因性バックグラウンドのレベルはどちらも、使用する各レポータータンパク質と細胞株によって異なります。一般的に使用される検出方法では、アイソトープ性、比色性、蛍光性、または発光性の酵素基質、およびアイソトープ性、比色性、化学発光エンドポイントでのイムノアッセイに基づいた手順が用いられています。

一般的なレポーター遺伝子

β-ガラクトシダーゼ
β-ガラクトシダーゼは、従来より、比色基質のONPG（o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside）［1］ を用いて検出され、トランスフェクション効率を正常化させるために、しばしば他のレポーター遺伝子と併せて使用されます。表に示すように[web designer link to table]、この比色アッセイでは、他の多くのレポーター遺伝子アッセイと比べて感度は低くなります。β-ガラクトシダーゼ用のNovaBright™ 1,2-ジオキセタン化学発光基質では、感度が飛躍的に向上します。［2、3］

その他の一般的なレポーター遺伝子についてはこちら >


胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ
胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）は、細胞から培地中に直接分泌され、細胞の培地の試料を採取するだけでアッセイを行えます。分泌型レポータータンパク質では、細胞の培地の非破壊アッセイが可能となり、それにより、追加のアッセイ用に細胞を保存でき、また時間経過に伴う遺伝子発現のモニタリングが可能になります。SEAPは、比色基質および化学発光基質のどちらを用いても検出できます。NovaBright™ 化学発光SEAPレポーター遺伝子アッセイは、優れた感度と使いやすさを発揮します。

ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼはレポーター遺伝子として加速的に普及 しており、特にトランスフェクション効率の正常化が重要となるコトランスフェクション系の実験において顕著です。NovaBright™ β-ガラクトシダーゼおよびホタルルシフェラーゼ 両酵素用レポーター遺伝子アッセイは、感度が高く作業手順が容易です。また、同一の反応ウェルまたは反応チューブで一定量の細胞抽出物１つから両方の測定を行えるため、実験誤差を最小限に抑えることができます。

注目のデータと製品に関する引用文献

レポーター遺伝子
検出方法検出限界利点欠点
クロラムフェニコールアセチル転移酵素（CAT）アイソトープ性、
ELISA		5 x 107 mol、
1 x 109 mol		広範使用、
無放射能		放射性、
高コスト、
低ダイナミックレンジ、
多大な労力、
１アッセイあたりのコストが高い
β-ガラクトシダーゼONPG（発色）、
MUG （蛍光）、
NovaBright™ β-ガラクトシダーゼシステム、
NovaBright™ SEAP システム		3 x 108mol、
6 x 105 mol、
3 x 103 mol		高感度性、
広ダイナミックレンジ、
簡易性		感度不良、
自己蛍光
ヒト成長因子ラジオイムノアッセイ3 x 108 mol培地に分泌放射能、
１アッセイあたりのコストが高い、
低感度
ルシフェラーゼNovaBright™ デュアルβ-ガラクトシダーゼおよびホタルルシフェラーゼシステム103–104 molアッセイの簡易性、
広いダイナミックレンジ		タンパク質の不安定性
分泌型アルカリホスファターゼpNPP（発色）、
NovaBright™ SEAPシステム		1 x 108 mol、
3 x 104 mol		培地に分泌、
高感度、
広いダイナミックレンジ		感度不良

NovaBright™に関する引用文献

NovaBright™ レポーター遺伝子アッセイ製品を使用した文献一覧をご参照ください。



1.Alexander L, Illyinskii PO, Lang SM et al.(2003) Determinants of increased replicative capacity of serially passaged Simian Immunodeficiency Virus with nef deleted in Rhesus monkeys.J Virol 77:6823–6835.
2. Berger J, Hauber J, Hauber R et al. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.Gene 66:1–10.
3.Bronstein I, Fortin JJ, Voyta JC et al.(1994a) Chemiluminescent reporter gene assays: Sensitive detection of the GUS and SEAP gene products.Biotechniques 17:172–178.
4.Brown MA, Zhao Q, Baker KA et al.(2005) Crystal structure of BMP-9 and functional interactions with pro-region and receptors.J Biol Chem 280:25111–25118.
5. Cao HB, Wang A, Martin B et al. (2005) Down-regulation of IL-8 expression in human airway epithelial cells through helper-dependent adenoviral-mediated RNA interference.Cell Res 15:111–119.
6.Cullen B, Malim M (1992) Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene.MethodsEnzymol 216:362–368.
7.Duboise M, Guo J, Czajak S et al.(1998) A role for Herpesvirus Saimiri orf14 in transformation and persistent infection.J Virol 72:6770–6776.
8.Hobbs WE, Brough DE, Kovesdi I et al.(2001) Efficient activation of viral genomes by levels of Herpes Simplex Virus ICP0 insufficient to affect cellular gene expression or cell survival.J Virol 75:3391–3403.
9. Hwang DR, Tsai YC, Lee JC et al. (2004) Inhibition of Hepatitis C virus replication by arsenic trioxide.Antimicrob Agents Chemother 48:2876–2882.
10.Johnson WE, Morgan J, Reitter J et al.(2002) A replication-competent, neutralization-sensitive variant of Simian Immunodeficiency Virus lacking 100 amino acids of envelope.J Virol 76:2075-2086.
11.Kagan JC, Stein MP, Pypaert M et al.(2004) Legionella subvert the functions of Rab1 and Sec22b to create a replicative organelle.J Exp Med 199:1201–1211.
12. Khan AS, Smith LC, Abruzzese RV et al. (2003) Optimization of electroporation parameters for the intramuscular delivery of plasmids in pigs.DNA Cell Biol 22:807–814.
13.Latta-Mahieu M, Rolland M, Caillet C et al.(2002) Gene transfer of a chimeric trans-activator is immunogenic and results in short-lived transgene expression.Hum Gene Ther 13:1611–1620.
14.Pohlmann S, Krumbiegel M, Kirchhoff F (1999) Coreceptor usage of BOB/GPR15 and Bonzo/STRL33 by primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.J Gen Virol 80:1241–1251.
15. Poser S, ImpeyS, Xia Z et al. (2003) Brain-derived neurotrophic factor protection of cortical neurons from serum withdrawal-induced apoptosis is inhibited by cAMP.J Neurosci 23:4420–4427.
16. O’Connor KL, Culp LA (1994) Quantitation of two histochemical markers in the same extract using chemiluminescent substrates.BioTechniques 17:502–509.
17.Riera M, Chillon M, Aran JM et al.(2004) Intramuscular SP1017-formulated DNA electrotransfer enhances transgene expression and distributes hHGF to different rat tissues.J Gene Med 6:111–118.
18. Rubenstrunk A, Orsini C, Mahfoudi A et al. (2003) Transcriptional activation of the metallothionein I gene by electric pulses in vivo: Basis for the development of a new gene switch system.J Gene Med 5:773–783.
19. Sakai J, Rawson RB, Espenshade PJ et al. (1998) Molecular identification of the sterol-regulated luminal protease that cleaves SREBPs and controls lipid composition of animal cells.Mol Cell 2:505–514.
20.Zabeau L, Defeau D, Van der Heyden J et al.(2004) Functional analysis of leptin receptor activation using a Janus kinase/signal transducer and activator of transcription complementation assay.Mol Endocrinol
21.Zhang J, Ou J, Bashmakov Y et al.(2001) Insulin inhibits transcription of IRS-2 gene in rat liver through an insulin response element (IRE) that resembles IREs of other insulin-repressed genes.Proc Natl Acad Sci U S A
22.Zhao H, Peeters BPH (2003) Recombinant Newcastle Disease Virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.J Gen Virol 84:781–788.

レポーター遺伝子アッセイの比較
レポーター遺伝子
検出方法検出限界利点欠点
クロラムフェニコールアセチル転移酵素（CAT）アイソトープ性、
ELISA		5 x 107 mol、
1 x 109 mol		広範使用、
無放射能		放射性、
高コスト、
低ダイナミックレンジ、
多大な労力、
１アッセイあたりのコストが高い
β-ガラクトシダーゼONPG（発色）、
MUG （蛍光）、
NovaBright™ β-ガラクトシダーゼシステム、
NovaBright™ SEAP システム		3 x 108mol、
6 x 105 mol、
3 x 103 mol		高感度性、
広ダイナミックレンジ、
簡易性		感度不良、
自己蛍光
ヒト成長因子ラジオイムノアッセイ3 x 108 mol培地に分泌放射能、
１アッセイあたりのコストが高い、
低感度
ルシフェラーゼNovaBright™ デュアルβ-ガラクトシダーゼおよびホタルルシフェラーゼシステム103–104 molアッセイの簡易性、
広いダイナミックレンジ		タンパク質の不安定性
分泌型アルカリホスファターゼpNPP（発色）、
NovaBright™ SEAPシステム		1 x 108 mol、
3 x 104 mol		培地に分泌、
高感度、
広いダイナミックレンジ		感度不良
NovaBright に関する引用文献

NovaBright™に関する引用文献

NovaBright™ レポーター遺伝子アッセイ製品を使用した文献一覧をご参照ください。



1.Alexander L, Illyinskii PO, Lang SM et al.(2003) Determinants of increased replicative capacity of serially passaged Simian Immunodeficiency Virus with nef deleted in Rhesus monkeys.J Virol 77:6823–6835.
2. Berger J, Hauber J, Hauber R et al. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.Gene 66:1–10.
3.Bronstein I, Fortin JJ, Voyta JC et al.(1994a) Chemiluminescent reporter gene assays: Sensitive detection of the GUS and SEAP gene products.Biotechniques 17:172–178.
4.Brown MA, Zhao Q, Baker KA et al.(2005) Crystal structure of BMP-9 and functional interactions with pro-region and receptors.J Biol Chem 280:25111–25118.
5. Cao HB, Wang A, Martin B et al. (2005) Down-regulation of IL-8 expression in human airway epithelial cells through helper-dependent adenoviral-mediated RNA interference.Cell Res 15:111–119.
6.Cullen B, Malim M (1992) Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene.MethodsEnzymol 216:362–368.
7.Duboise M, Guo J, Czajak S et al.(1998) A role for Herpesvirus Saimiri orf14 in transformation and persistent infection.J Virol 72:6770–6776.
8.Hobbs WE, Brough DE, Kovesdi I et al.(2001) Efficient activation of viral genomes by levels of Herpes Simplex Virus ICP0 insufficient to affect cellular gene expression or cell survival.J Virol 75:3391–3403.
9. Hwang DR, Tsai YC, Lee JC et al. (2004) Inhibition of Hepatitis C virus replication by arsenic trioxide.Antimicrob Agents Chemother 48:2876–2882.
10.Johnson WE, Morgan J, Reitter J et al.(2002) A replication-competent, neutralization-sensitive variant of Simian Immunodeficiency Virus lacking 100 amino acids of envelope.J Virol 76:2075-2086.
11.Kagan JC, Stein MP, Pypaert M et al.(2004) Legionella subvert the functions of Rab1 and Sec22b to create a replicative organelle.J Exp Med 199:1201–1211.
12. Khan AS, Smith LC, Abruzzese RV et al. (2003) Optimization of electroporation parameters for the intramuscular delivery of plasmids in pigs.DNA Cell Biol 22:807–814.
13.Latta-Mahieu M, Rolland M, Caillet C et al.(2002) Gene transfer of a chimeric trans-activator is immunogenic and results in short-lived transgene expression.Hum Gene Ther 13:1611–1620.
14.Pohlmann S, Krumbiegel M, Kirchhoff F (1999) Coreceptor usage of BOB/GPR15 and Bonzo/STRL33 by primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.J Gen Virol 80:1241–1251.
15. Poser S, ImpeyS, Xia Z et al. (2003) Brain-derived neurotrophic factor protection of cortical neurons from serum withdrawal-induced apoptosis is inhibited by cAMP.J Neurosci 23:4420–4427.
16. O’Connor KL, Culp LA (1994) Quantitation of two histochemical markers in the same extract using chemiluminescent substrates.BioTechniques 17:502–509.
17.Riera M, Chillon M, Aran JM et al.(2004) Intramuscular SP1017-formulated DNA electrotransfer enhances transgene expression and distributes hHGF to different rat tissues.J Gene Med 6:111–118.
18. Rubenstrunk A, Orsini C, Mahfoudi A et al. (2003) Transcriptional activation of the metallothionein I gene by electric pulses in vivo: Basis for the development of a new gene switch system.J Gene Med 5:773–783.
19. Sakai J, Rawson RB, Espenshade PJ et al. (1998) Molecular identification of the sterol-regulated luminal protease that cleaves SREBPs and controls lipid composition of animal cells.Mol Cell 2:505–514.
20.Zabeau L, Defeau D, Van der Heyden J et al.(2004) Functional analysis of leptin receptor activation using a Janus kinase/signal transducer and activator of transcription complementation assay.Mol Endocrinol
21.Zhang J, Ou J, Bashmakov Y et al.(2001) Insulin inhibits transcription of IRS-2 gene in rat liver through an insulin response element (IRE) that resembles IREs of other insulin-repressed genes.Proc Natl Acad Sci U S A
22.Zhao H, Peeters BPH (2003) Recombinant Newcastle Disease Virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.J Gen Virol 84:781–788.

レポーター遺伝子アッセイの比較

レポーター遺伝子
検出方法検出限界特長欠点
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）アイソトープ性、
ELISA		5 x 107 mol、
1 x 109 mol		広範使用、
無放射能		放射性、
高コスト、
低ダイナミックレンジ、
多大な労力、
１アッセイあたりが高コスト
β-ガラクトシダーゼONPG（発色）、
MUG （蛍光）、
NovaBright™ β-ガラクトシダーゼシステム、
NovaBright™ SEAP システム		3 x 108mol、
6 x 105 mol、
3 x 103 mol		高感度、
広ダイナミックレンジ、
簡易性		感度不良、
自己蛍光
ヒト成長因子ラジオイムノアッセイ3 x 108 mol培地に分泌放射能、
１アッセイあたりのコストが高い、
低感度
ルシフェラーゼNovaBright™ デュアルβ-ガラクトシダーゼおよびホタルルシフェラーゼシステム103–104 molアッセイの簡易性、
広ダイナミックレンジ		タンパク質の不安定性
胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼpNPP（発色）、
NovaBright™ SEAPシステム		1 x 108 mol、
3 x 104 mol		培地に分泌、
高感度、
広ダイナミックレンジ		感度不良

参考文献

  1. Alam J, Cook JL (1990) Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription.Anal Biochem 188:245–254.
  2. Bronstein I, Martin CS, Fortin JJ, Olesen CE, Voyta JC (1996) Chemiluminescence: Sensitive detection technology for reporter gene assays.Clin Chem 42:1542–1546.
  3. Bronstein I, Fortin J, Stanley PE, Stewart GS, Kricka LJ (1994) Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.Anal Biochem 219:169-181.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.