アビジン-ビオチン相互作用

アビジンは、ビオチンに対して極めて高い親和性を示す、鳥類および両生類の両群に由来するタンパク質であり、様々な真核生物学的プロセスにおいて作用する補因子です。下図に示すように、ストレプトアビジンやニュートラタンパク質といったアビジンやビオチン結合性タンパク質は、最大4個のビオチン分子に結合する能力があるため、この相互作用は精製および検出の両戦略において理想的です。

アビジン-ビオチン複合体は、タンパク質とリガンド間の既知の非共有結合性相互作用 (K_d = 10^-15M) の中では最も強力です。ビオチンとアビジン間の結合は非常に素早く形成されます。そして結合が形成された後には、極端なpH値、温度、有機溶剤、変性剤類からの影響を受けません。ビオチンおよびアビジンのこうした特性（ストレプトアビジンおよびニュートラタンパク質にも共通した特性）は、相互作用成分のいずれかへ結合したタンパク質の精製や検出に役立ちます。

アビジン-ビオチン相互作用が利用されるアプリケーション：

• 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
• 免疫組織化学（IHC）
• ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、およびサザンブロッティング
• 免疫沈降
• 細胞表面の標識化
• 親和性精製
• 蛍光活性化細胞選別（FACS）
• 電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

二次抗体と同様に、アビジン-ビオチン検出システムにより、ほぼ無制限数の第一検出試薬（抗体、核酸プローブおよびリガンド）を容易に捕獲、回収、固定化または検出することができます（アビジンまたはストレプトアビジンの修飾により生成される二次検出試薬は、微量に捕獲、回収、固定化または検出されます）。また、特異的ビオチン化分子を入手できない場合、ラボ内でのビオチン化を実現させる様々な市販試薬をご利用ください。同様に、必要に応じてアビジンやストレプトアビジンを変更することも可能です。

アビジン-ビオチン系は調整法や使用法がシンプルですが、一定の制限があります。ビオチン化分子は、ビオチン結合性タンパク質へ結合する性質があるため、多重実験では他の検出プローブシステム（一次/二次抗体）と併せて、これらの試薬を使用する必要があります。

また、ビオチンは生体分子であるため、特定ビオチンの豊富な組織や抽出物（脳、肝臓、牛乳、卵、トウモロコシ）を用いたアッセイを行う場合、内因性ビオチンが原因でバックグラウンドや特異性の問題が発生する可能性があります。このことは、卵（アビジンの供給源）またはストレプトマイセス アビジニ（ストレプトアビジンの供給源）といった、内因性ビオチン結合性タンパク質を含有したサンプルにも当てはまります。

精製アプリケーションにおいて、ビオチンとアビジン間の結合相互作用の強度は、その有用性が制限される因子となります。これは、アビジン-ビオチン結合を破壊（すなわち解離・溶出させる）するには、過酷な条件が求められることに起因します。そして、これらにより標的タンパク質が変性することがあります。こうした制限を克服するには、相互作用を可逆化させる効能のある市販製品の修飾版アビジン樹脂やビオチン標識試薬（修飾済み形態）をご利用ください。これらには、単量体アビジン、切断可能ジスルフィドビオチン試薬、イミノビオチン誘導体、デスチオビオチン誘導体などが含まれます（下記「タンパク質の単離および濃縮」にて詳細をご覧ください）。

ビタミン（ビタミンH、ビタミンB7、コエンザイムR）の一種であるビオチンは、全ての生細胞中に微量に存在しており、細胞増殖やクエン酸回路をはじめとした様々な生物学的プロセスにおいて決定的な要素です。ビオチンは、トウモロコシ穀粒、卵黄、脳、肝臓、血液などの特定の植物や動物の組織中に豊富に存在します。分子へビオチンタグを付加させる種々の反応性基を組み込むため、ビオチン分子の吉草酸側鎖を誘導体化させることができます。ビオチン（244.3ダルトン）は比較的小さいため、生物学的活性を著しく変化させずに、様々なタンパク質や分子類へ結合させることができます。ビオチンとビオチン結合性タンパク質の間の高特異的相互作用は、生物学的分析物の検出および標的化を行うアッセイ系において有効なツールとなります。

ビオチンが分子へ結合された後、ビオチンタグを利用することにより、固定化ビオチン結合性タンパク質を用いてビオチン結合分子の親和性精製を促進させることができますまた、ビオチン結合性タンパク質との相互作用を介して固定化したビオチン化分子を用いて、そのビオチン化分子と特異的相互作用する分子を親和性精製する方法もあります（免疫共沈降アッセイまたはプルダウンアッセイ）。免疫組織化学やイムノブロッティングの環境では、ビオチンは一般に一次抗体または二次抗体へ結合されます。そして、酵素、フルオロフォアまたはレポーター分子へ結合されたビオチン結合性タンパク質により、ビオチンタグが検出されます。抗体をはじめとした様々なタンパク質は、ビオチン結合タンパク質による結合が可能な各種ビオチンタグで標識を施すことができます。ビオチン：プローブ比が最適化されると、検出システムのシグナル出力を飛躍的に強化できるため、極めて高感度なアッセイを作成することができます。

ビオチン標識済みの抗体および分子は、代理店からご購入可能です。これらをご活用して、多様なアプリケーションにおけるアッセイ開発手順が実現します。ビオチン化プローブが利用できないアッセイには、様々なビオチン化試薬がご利用できます。これらの試薬を使用して、カスタムアッセイ試薬を作製するために研究者ご自身の手でタンパク質、核酸および表面材料へ化学標識を行えます。

ビオチン結合性タンパク質であるアビジンは、鳥類、爬虫類および両生類の卵中で抗生物質として機能すると考えられています。ニワトリアビジンは質量67,000～68,000ダルトンを有しており、4個の128アミノ酸サブユニット（各サブユニットは一個のビオチン分子に結合）から形成されています。アビジンは、高グリコシル化された形態で、全質量の約10%が炭水化物から構成されています。また、アビジンは塩基性等電点(pI) 10～10.5および水と塩水溶液中での高溶解性に寄与します。アビジンは鶏の卵白から容易に精製できるため、極めて安価に産出できます（ストレプトアビジンよりも大幅に低コスト）。

アビジンは最大4つのビオチン分子に対して極めて高い親和性を有しており、広範なpH範囲および温度範囲で安定しながら適正に機能します。アビジンは、機能性にほとんど影響しない多種多様な化学的修飾に適しているため、様々な条件下におけるビオチン化分子検出やタンパク質精製の用途に有用です。アビジンによるビオチンとの特異的相互作用は、高感度な非放射性検出システムを設計するための有効ツールとなります。炭水化物含量およびアビジンの塩基性等電点(pI)により、高量の非特異的結合がもたらされます。そのため、ブロッキングバッファを使用した場合に最良のアッセイ結果を得るには、ブロッキング条件と洗浄条件を入念に最適化させる必要があります。

ストレプトアビジンは、四量体のビオチン結合性タンパク質であり、ストレプトマイセス アビジニから単離され、質量60,000ダルトンを有しています。アビジンとストレプトアビジンは、アミノ酸相同性をほとんど有していませんが、お互いの構造は極めて類似しています。アビジンと同様に、ストレプトアビジンは、抗生物質として機能すると考えられており、ビオチンに対して非常に高い親和性があります (K_d = 10^{-14 ～15}M)。アビジンとは異なり、ストレプトアビジンは炭水化物を有さず、アビジンより著しく低い溶解性をストレプトアビジンへもたらす、酸性等電点（pI = 5）を有しています。ストレプトアビジン市販製品のひとつであるThermo Scientific Pierce Streptavidinは、質量53,000ダルトン、中性に近い等電点（pI=7.5～6.8）を有した組換え型ストレプトアビジンです。

ストレプトアビジンはグリコシル化が欠如した上にpI値が比較的低いため、特にレクチン結合における非特異的結合度は、免疫組織化学アプリケーションで観察されるアビジン結合度よりも低くなります。このため、ストレプトアビジンは様々な検出システムにおいて理想的な試薬となります。対照的に、ストレプトアビジンはRYDモチーフと呼ばれる細菌の認識配列を含有しています。このRYDモチーフは、哺乳類RGDモチーフに類似しており、細胞表面受容体へ結合することがあり、特定のアッセイサンプル中でバックグラウンドシグナルを発生させます。また、ネイティブ型および組換え型の両ストレプトアビジンは産出にかかる費用が非常に高額であり、アビジンベースのアッセイ試薬よりも高コストとなります。

アビジンおよびストレプトアビジンには、それぞれの主要な利点と欠点があります。アビジンの主要な利点は、産出コストが低く、溶解性が高い点です。また、主要な欠点としては、pI値が高く、非特異的相互作用やレクチン結合を起こす傾向の高い点が挙げられます。ストレプトアビジンは、非特異的結合性が低く、中性に近いpIを有しています。しかし、ストレプトアビジンは、産出コストが比較的高いうえ、特定アプリケーションでRYG配列による特異性問題が発生します。つまり、最も理想的な試薬とは、アビジンまたはストレプトアビジンいずれにも非特異的結合の問題がなく、中性に近いpIを有したうえ、産出の費用対効果に優れた試薬と言えるでしょう。まさに、これは脱グリコシル化アビジンを用いて達成ができます。

脱グリコシル化アビジンの市販製品であるThermo Scientific NeutrAvidin Proteinは、ネイティブ型のアビジンおよびストレプトアビジンの両主要欠点を克服しました。ニュートラタンパク質（60,000ダルトン）は、アビジン（67,000ダルトン）に比べて質量が低く、高いビオチン結合親和性を保持します。アビジンのグリコシル化により、検出不可能レベルの低等電点（pI=6.3）へのレクチン結合が軽減され、アビジンの非特異的結合を起こす主要原因を効果的に取り除きます。リジン残基が利用可能な状態で維持されるため、ストレプトアビジンと同様にニュートラアビジンタンパク質を円滑に誘導体化または結合させられますが、RYD配列を欠いているためIHCアッセイで非特異的結合が発生する可能性があります。ビオチン結合親和性が高いと同時に非特異的結合度が低いことから、ニュートラアビジンタンパク質は最も理想的なビオチン結合性タンパク質と言えます。

アビジン-ビオチン系は様々なラボメソッドに活用できます。主要メソッドでは、ビオチン化プローブの検出にアビジンまたはストレプトアビジンを使用します。以下の項では、アビジン-ビオチン系を効果的に活用した主要ラボメソッドのいくつかについて概説いたします。

タンパク質検出は、タンパク質の精製、産出、発現レベルなどの監視に用いる主要なラボメソッドです。タンパク質の大半は、複合サンプル中の他のタンパク質と区別しづらいため、抗体や標的特異的プローブ類を用いて、特異的タンパク質の間接検出を促進させます。アビジン-ビオチン系を活用すると、蛍光または酵素いずれかの検出試薬に結合したビオチン結合性タンパク質で、ビオチン化された一次抗体や二次抗体を検出することができます。この方式を用いた標準アッセイとしては、IHC、ウェスタンブロッティング、ELISAなどが挙げられます。

タンパク質検出にアビジン-ビオチン系を使用する主な利点には、大型のアビジン-ビオチン複合体の形成により低レベル発現したタンパク質の検出を向上させるために、元のタンパク質シグナルを増幅させる能力が挙げられます（下図をご参照ください）。これらの複合体は、シグナル検出を高めるため、標的抗原部位への結合レポーター（フルオロフォアまたは酵素）を濃縮します。

タンパク質検出は、タンパク質の精製、産出、発現レベルなどの監視に用いる主要なラボメソッドです。タンパク質の大半は、複合サンプル中の他のタンパク質と区別しづらいため、抗体や標的特異的プローブ類を用いて、特異的タンパク質の間接検出を促進させます。アビジン-ビオチン系を活用すると、蛍光または酵素いずれかの検出試薬に結合したビオチン結合性タンパク質で、ビオチン化された一次抗体や二次抗体を検出することができます。この方式を用いた標準アッセイとしては、IHC、ウェスタンブロッティング、ELISAなどが挙げられます。

タンパク質検出にアビジン-ビオチン系を使用する主な利点には、大型のアビジン-ビオチン複合体の形成により低レベル発現したタンパク質の検出を向上させるために、元のタンパク質シグナルを増幅させる能力が挙げられます（下図をご参照ください）。これらの複合体は、シグナル検出を高めるため、標的抗原部位への結合レポーター（フルオロフォアまたは酵素）を濃縮します。

また、主要ラボメソッドのひとつである核酸検出は、特定ポリヌクレオチドの存在、存在量または配列の測定に用います。多くの研究室では、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）などの極めて迅速型の検出方式へと切り替えられていますが、ノーザン/サザンブロッティングは、特異的なDNAやRNAの配列ならびにサイズおよび整合性を確認するための有効手段として現在も利用され続けています。PCR法ほど処理が迅速ではありませんが、この技法は、大規模クローンスクリーニングを実行する際、in situでの細菌コロニーおよびバクテリオファージプラークへのハイブリダイゼーションにも有益です。

これらの手法において、標的ヌクレオチド断片はブロッティング膜上へ転写され固定化されます。そして、厳密なブロッキング手順に従って、標的配列はビオチン化相補的なヌクレオチドプローブとハイブリダイズされます。その後、検出試薬に結合したビオチン結合性タンパク質を用いて、ビオチンタグを局在化および検出することができます。

アビジン-ビオチン戦略を取ると、免疫沈降（IP）アッセイを簡素化および強化させることができます。手順のタイプによっては、結合を開始させるために、直接アッセイサンプルへ抗体を添加した後、プロテインAアガロースまたは類似の支持体を用いて抗体-標的複合体を捕獲することもあります。また、最初に抗体を固定化させてから、標的抗原の捕獲にその抗体を使用するタイプの手順もあります。上述いずれの手順においても、サンプル中の免疫グロブリンの存在（特に後者のケースにおいて）により、標的抗原の回復を大幅に減少させることができ、非特異的相互作用を潜在的に増加させます。また、抗体-抗原複合体が複合サンプルから捕獲されている場合、プロテインAなどの支持体が抗体固定化に十分な時間をかけられるように、長時間インキュベーションを行う必要があります。こうした問題は、ビオチン化一次抗体や固定化されたビオチン結合性タンパク質を使用することによって解決できます。ビオチン結合性タンパク質はビオチンタグへのみ結合するため、内因性免疫グロブリンは問題の発生原因にはなりません。また、ビオチンに対する親和性が非常に強力なため、固定化済みの抗体または抗体-抗原複合体いずれかのインキュベーション時間は、目標濃度、サンプル粘度、および変動の主要発生源である容量に関してのみ一貫性が比較的高くなります。

アビジン-ビオチン化学の活用により、免疫沈降の他に、様々なタイプの小規模な精製戦略や濃縮戦略が実現します。例えば、膜不透過性ビオチン化試薬を使用すると、細胞表面タンパク質にタグ付けをして、他の全細胞性タンパク質からこれらタグ付けタンパク質の分離を促進させることができます。より高度な化学では、ビオチンタグを使用して、ATPアーゼ、GTPアーゼおよびセリンヒドロラーゼなどの特定種のタンパク質を特異的に濃縮することができます。特に新規タンパク質の発見方法として抗体のみを使用していては、こうした実験は実現できません。

しかし、これらの濃縮戦略（ストレプトアビジン樹脂からビオチン標識標的を溶出・回収する目的の場合）では、一般に標準的なアビジン-ビオチン系を適合させる必要があります。天然相互作用は解離に対して非常に強力かつ高耐性であることから、この適合化が必要になります。アビジン-ビオチン複合体を効果的に解離させるには、過酷な変性条件（pH=1.5の8 Mグアニジン塩酸、またはSDSサンプルローディングバッファ中での煮沸）が求められます。このような条件下では、支持体が不可逆的損傷を受けるため、再利用ができなくなります。また、溶出したタンパク質は、変性を起こし、いかなる生物学的活性も維持しなくなります。

1. 単量体アビジン樹脂： ネイティブ四量体タンパク質とは異なり、単量体アビジンサブユニットはビオチンへの結合力が比較的弱いため、過剰の遊離ビオチンを用いて、捕獲されたビオチン化標的を競合的に置換することができます。
2. 切断可能なビオチン化試薬：特定のビオチン化試薬には、スペーサーアーム内でのジスルフィド結合を含み、あるいは ジスルフィド結合を介してタンパク質へ結合します。還元剤でジスルフィド結合を切断することにより、親和性樹脂からビオチン化タンパク質を溶出させることができます。ビオチン基が樹脂に結合したまま、タンパク質（ビオチン標識非含有）が回収されます。Cell Surface Protein Isolation Kiは、この戦略（スルホ-NHS-SS-ビオチンで標識化）を活用します。
3. デスチオビオチンおよびイミノビオチン誘導体：アビジンおよびストレプトアビジンタンパク質への結合力を弱めたビオチンの修飾形態が存在します。Active-Site Probes and Enrichment Kitsは、デスチオビオチン試薬を使用しています。様々な官能基でタンパク質を標識化する用途に、数種類のデスチオビオチン化試薬が取り揃えられています。

免疫沈降法と同様に、従来の免疫共沈降アッセイでは、標的抗原を捕獲するには特異的な一次抗体が必要になります。共免疫沈降において、標的抗原は一般に「ベイト」タンパク質と呼ばれています。そして、ベイトタンパク質を用いて、付加的な相互作用性の「プレイ」タンパク質を回収することが最終目標です。免疫沈降アッセイと同様に、ビオチン化捕捉抗体を使用すれば、捕獲および濃縮のプロセスに関連した潜在的問題を克服できます。しかし、共免疫沈降アッセイはさらに修飾できるため、捕捉抗体は一切必要ありません。得られるプルダウンアッセイは、一般にタグ付きベイトタンパク質を用いて実行されます。様々なアプリケーションにおいて、タグ付きベイトタンパク質には、数タイプの親和性タグのうちの1種で修飾された組換え融合タンパク質（6ヒスチジン、ヘマグルチニン抗原、グルタチオンS-トランスフェラーゼなど）が用いられますが、ビオチン化ベイトタンパク質を用いてこれらのアッセイを実行することも可能です。ベイトタンパク質に必要な処理は、プルダウンアッセイ実行前にビオチンタグで修飾するだけです。精製ベイトタンパク質の供給源が必要になるとはいえ、このようにプルダウンアッセイを実行すれば、組み換え修飾により不活性タンパク質や望ましくない人工産物が生成される際に発生し得る潜在的問題を克服できます。

プルダウンアッセイ用のベイトとして、タンパク質以外の物質も利用できます。ペプチド、薬物および核酸も、相互作用タンパク質を捕獲するベイトとして使用できます。また、これらのプローブを使用すると、捕獲および濃縮工程を取らずにタンパク質相互作用を検出できます。EMSAアッセイまたはゲルシフトアッセイでは、ゲルマトリックスを介した電気泳動中に、核酸結合タンパク質が原因で標識プローブの泳動速度が変化するため、この核酸結合タンパク質の検出が可能になります。最適化された検出システムにおいて、このようにビオチン化プローブを使用すると非常に効果的です。

また、タンパク質相互作用を検出するには、標識導入法という高度な手法を取ることも可能です。この技法手順では、転写可能タグでベイトタンパク質を修飾します。標識導入法用の試薬は、2つの反応性基を備えています。第1反応性基がベイトタンパク質と反応し、ベイトおよびプレイタンパク質間の相互作用が確立された後、第2反応性基が活性化されます。タグがビオチンである場合、こうした標識導入試薬の効力により、後続工程の同定において相互作用標的タンパク質の捕獲と濃縮が可能になります。

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