SeqStudio Genetic Analyzer アプリケーション

サンガーシーケンシングの最も一般的なアプリケーションの 1 つは、プラスミド内に導入された遺伝子のサブクローン解析です。Applied Biosystems BigDye ケミストリは、サンガーシーケンシングに広く使用されており、プラスミドシーケンシングワークフローの一部になっています。SeqStudio プラットフォーム上のいくつかの新しい特長は、ベーシックなプラスミドシーケンシング法を行う研究者に利点を提供します。本装置には、短いリード（300 塩基対未満）、中程度の長さのリード（500 塩基対）、および長い（600 塩基対超）用に最適化されたシーケンシングモジュールがあらかじめローディングされており、また、特定のニーズに合うよう装置上でのカスタム化も可能です。交換可能なカートリッジは、個々のプロジェクトおよびユーザーごとに管理可能です。クラウドベースの Sanger Quality Check アプリケーションは、シーケンシングトレースを解析するための一連の直観的ツールを提供します。クラウド接続により、シーケンシング情報の遠隔でのモニタリング、アクセスおよび共有が可能で、共同研究者が同一のデータセットを用いて迅速に解析することができます。

SeqStudio 装置のプラスミドシーケンシングの性能を、M13 プライマーと Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 ケミストリを使用した pGEM7zf+ プラスミドシーケンシングで確認しました。結果は、Thermo Fisher Cloud 上の Sanger Quality Check モジュールによるシーケンシングトレース解析によって取得しました（図 1）。ここに示す例では、同一のプラスミドについて 16 ウェルでシーケンシング反応を行い、SeqStudio Genetic Analyzer で 4 回のインジェクションを実施しました。トレーススコア、Peak Under Peak（PUP）値、連続リード長（CRL）、QV20+（QV が 20 を超える長さ）は、各サンプルで類似していました。他のストランド上のトレース、および Applied Biosystems BigDye Terminator v1.1 ケミストリを使用した他の実験でも同様の結果が得られました。これらのデータは、SeqStudio プラットフォームによって非常に高品質のプラスミドシーケンシングが行えることを実証しています。

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図 1.クラウドアプリ Sanger Quality Check によるシーケンシング品質の解析(A) ラン完了後、SeqStudio 装置は結果のシーケンスファイルおよび各塩基の品質スコアを表示します。(B) 独立した 16 の pGEM7zf+ シーケンシング反応産物のランを SeqStudio 装置で実行し、.ab1 ファイルをクラウドにアップロードして解析しました。これらの反応では極めて類似したシーケンシング測定値が得られました。CRL = 連続リード長、QV20+ = QV >20 のヌクレオチド数

臨床研究に SeqStudio Genetic Analyzer を導入することで、腫瘍組織中の変異アレルの検出および確認においてゴールドスタンダードの品質を維持することができます。SeqStudio システムに以下のツールを組み込むことで、サンガーシーケンシングのワークフローが簡素化されます：

• SeqStudio Genetic Analyzer には、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織からのフラグメント DNA の抽出用に最適化されたランニングモジュールがあらかじめ設定されています。
• クラウドベースの NGC モジュールは、次世代シーケンシング（NGS）で同定した変異（.vcf ファイル）とサンガーシーケンシングデータを迅速に比較・確認できます。
• Applied Biosystems Minor Variant Finder (MVF) Software および SeqStudio で作成されるサンガーシーケンスデータによって、わずか 5％程度のアレル変異が検出できます。
• Applied Biosystems BigDye Direct ケミストリおよび BigDye XTerminator ケミストリは、単一チューブでのシーケンシングおよびクリーンアップによってサンガーシーケンシングのワークフローを簡素化します。

 アプリケーションノート：サンガーシーケンシングによる FFPE サンプルにおける低頻度の体細胞変異の検出

腫瘍サンプル中の変異アレルを検出する SeqStudio GeneticAnalyzer の性能を、10 の異なる FFPE 腫瘍サンプルから抽出したゲノム DNA の解析、および四つの異なるホットスポット領域での変異頻度同定によって確認しました。変異アレルの頻度は、Ion Torrent Oncomine Oncology Focus Panel を使用した NGS および BigDye Direct/BigDye XTerminator ケミストリと MVF Software を使用したサンガーシーケンシングで同定しました。SeqStudio Genetic Analyzer で測定したアレル頻度は約 9％ ～ 70％の間で、NGS との良好な相関を示しました（図 1）。

そして、KRAS および NRAS において最も一般的な発がん性変異検出用のサンガーシーケンシングプライマーを含む 96 ウェルプレートを使用して、SeqStudio Genetic Analyzer の変異頻度の解析能力を確認しました。SeqStudio 装置によるマイナーアレル頻度の解析により、1 ng の FFPE 抽出 DNA 希釈物でアレル頻度が正確に測定されました（図 2A）。以上より、SeqStudio Genetic Analyzer を用いることで FFPE 組織由来サンプルにおいてレアアレル検出が可能であることが示されました。

さらに、クラウドベースの NGC アプリケーションではサンガーシーケンシングのデータがアンプリコンおよび検体で整理され、.vcf ファイルで候補変異シーケンスに正しくアラインされるため、NGS で同定した変異を容易に確認できます。NGC アプリケーションをがん研究ワークフローで使用する例として、Oncomine Oncology Focus パネルによって同定した NRAS 変異の存在をサンガーシーケンシングで検証した例を示しています（図 2B）。SeqStudio の結果からは、NRAS 変異（p.Ala59Thr）の存在が検証されました。NGC アプリケーションを用いることで NGS で検出された変異のサンガーシーケンスデータを用いた検証が容易に実施できることが示されました。

CRISPR-Cas9 システムなどによるゲノム編集技術は、多くの生物学研究者が利用可能な技術として急速にその使用が広がっており、生物学およびヘルスケアのすべての分野に革新をもたらしています。当社ではゲノム編集プロジェクトに必要な多くのツールを提供しています。ゲノム編集プロジェクトに不可欠な部分として、サンガーシーケンシング解析を容易にするとともに、ゲノム編集ワークフロー内に良好に適合する SeqStudio Genetic Analyzer の特長が挙げられます。特に、生成されるデータは、ゲノム編集の効率を解析するツールとして広く使用されている Tracking of Indels by Decomposition（TIDE）ソフトウェアと互換性があります。

 ホワイトペーパー：Genetic analysis tools for genome editing workflows
e-learning：Genome editing workflow facilitated by the Thermo Fisher Scientific portfolio solution

ゲノム編集プロジェクトにおける SeqStudio Genetic Analyzer の有用性を実証するために、HPRT または relA 遺伝子座中のターゲット部位付近にランダムな欠失を導入するよう編集された HEK293 細胞から全細胞溶解物を入手しました。編集部位を確認するためにサンガーシーケンシングデータをクラウドにアップロードし、Sanger Variant Analysis モジュールで解析しました (図 1)。編集部位が明確に同定され、開裂部分の下流に多くの混合塩基ピークが見られました。この初代培養物細胞中での編集効率を測定するために、TIDE ソフトウェアで解析しました。各ケースにおいて、各遺伝子座の欠失のスペクトルおよび頻度は、フォワードおよびリバース リードで生成されたデータを使用した場合のいずれもほぼ同一でした（図 2）。これらの頻度から、同一の編集を行った細胞集団の TOPO クローニングに続くサンガーシーケンシングで得られた結果が裏付けられています。

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図 2：TIDE ソフトウェアと混合集団を SeqStudio 装置でシーケンスして得られた HPRT 遺伝子座および relA 遺伝子座のゲノム編集イベントの解析。棒グラフは、示された数のヌクレオチドの欠失または挿入を有する集団の割合を表しています。編集の全体的な効率は（A）HPRT で約 80％、（B）relA 遺伝子座で約 20％でした。

ヒト疾患の発症に関する研究は、培養液で単離されたヒト細胞株を用いた in vitro での解析に大きく依存しています。しかしながら、in vitro で培養した細胞は、細胞株が誤って認識されていたり、無関係な細胞株がコンタミネーションしている可能性があることは、ますます認識されてきている問題です。細胞株の同一性の確認は、高度な多型性を示すショートタンデムリピート（STR）の高特異的な遺伝子「指紋」の解析によって検証することができます。SeqStudio プラットフォームには、ウェルとともに Thermo Fisher Scientific 細胞株認証ソリューションが組み込まれています。Applied Biosystems Identifiler Plus キットおよび Identifiler Direct キットはそれぞれ精製された DNA および粗精製 DNA の調製に用いられ、細胞株認証の検証に一般的に用いられる 16 ローカスのヒト STR を解析することができます。Applied Biosystems GeneMapper Software は、キットにより同定されたアレルを解析するために用いられ、SeqStudio 装置で生成されたデータと互換性があり、その結果は ATCC や他の STR データベースで照合して認証を確認するのに使用可能です。

 ケーススタディ：Matching identities of iPSCs and donors using CLA Identifiler STR profiling kits
 アプリケーションノート：Authenticating human cell lines using the Identifiler kits and capillary electrophoresis platforms
e-learning：A Complete Workflow for Human Cell Line Authentication

細胞株認証のワークフローにおける SeqStudio 装置の有用性を実証するために、一般的に用いられている 5 種類のヒト細胞株から STR に関するアレル情報を取得しました。細胞株の同一性は、わずか 300 pg の gDNA を用いて確認されました。混在している細胞を検出する能力を明らかにするために、M4A4GFP 細胞集団に HeLa 細胞をさまざまな割合で添加し、Identifiler Direct キットを用いて解析しました。細胞集団中の HeLa 細胞の割合がわずか 10％でも、HeLa 細胞に特異的なアレルが検出できました（図 1）。このことから、Identifiler キットを組み合わせて使用する場合、SeqStudio 装置は細胞株認証ソリューションの中心的なコンポーネントであると言えます。

図 1.SeqStudio 装置上での細胞株コンタミネーションの解析M4A4GFP 細胞に HeLa 細胞を表に記載の割合で混合した細胞懸濁液を 5 x 10⁵ cells/mL に希釈し、NUCLEIC-CARD Sample Collection Device 上にスポットしました。細胞集団に混在している HeLa 細胞は、その割合が約 20％ であっても高い信頼性をもって SeqStudio 装置上で検出可能でした。わずか 10％でも、HeLa に固有のアレルの一部が検出されました。

DNA リピート伸長は、任意の数のマルチヌクレオチド反復を持つ DNA 変異を表す用語です。多くの場合、これらの領域は GC 含量が高いことから、増幅困難であるため、特性を評価することが困難とされます。ショートタンデムリピート（STR）は、リピート DNA のカテゴリーの一つです。STR には、ゲノム DNA の長い領域にわたり繰り返される一～六つのヌクレオチドのバーストが含まれ、30 以上の衰弱性遺伝性疾患を理解するのに極めて重要です。

CE によるフラグメントのサイズ決定は、とりわけ疾患に関連する DNA のリピートセクションの解明に対応します。これらの領域は GC 含量が高いことが多いため、増幅および解析することが特に困難です。そのため、SeqStudio Genetic Analyzer は、これらの困難な領域をうまく解析するために Asuragen AmplideX™ PCR/CE FMR1 および C9orf72 試薬を使用するのに推奨されるインジェクションおよびラン設定を確立・検証するために評価されました。 　 FMR1 は、遺伝子内のリピート伸長が衰弱 X 症候群を発症させる遺伝子です。同様に、C9orf72 は、遺伝子内のリピート伸長が前頭側頭葉認知症、筋委縮性側索硬化症（ALS）のいずれか、または両方を発症させる遺伝子です。

ホワイトペーパー：The SeqStudio Genetic Analyzer simplifies the analysis of triplet repeat expansions with AmplideX PCR/CE reagents

AmplideX PCR/CE 試薬は、repeat-primed PCR および CE によって、STR 領域を包含する完全長の増幅産物および病原性アレルの確証的なピークパターンを提供する repeat-primed 増幅産物をレポートするために利用されます。このアプローチは、Applied Biosystems 3130、3500、および 3730 CE プラットフォーム上でよく確立されており、2010 年から 75 報以上の論文に掲載されています。  しかしながら、より短いアレイおよび POP-1 ゲルポリマーを SeqStudio CE 装置で使用するためには、従来の装置での AmplideX PCR 試薬の性能に相当するようにラン設定を最適化することが必要とされます。この目的のために、AmplideX PCR/CE 試薬に対する性能要件を満たすための SeqStudio 装置に特定のラン設定を決定・確認する一連の実験を行いました。800 塩基対を超えるサイズ決定が必要とされる Asuragen 社製の FMR1 および C9orf72 のような長いフラグメントのアッセイ用のランパラメータを決定するための実験を優先的に設計しました。　 使いやすい SeqStudio システムをリピート伸長に対応する AmplideX PCR 試薬とともに用いることで、困難とされる GC- および AT-リッチのリピート伸長のジェノタイピングが行えます。　

SeqStudio システム上で FragAnalysis または LongFragAnalysis モジュールがシグナル強度に与える影響は同等でした。  しかしながら、FragAnalysis モジュールを使用すると より高いシグナル強度が得られたのに対し（約 50％高いシグナル強度）、シグナル飽和状態の遺伝子特異的なピークではスプリットピークの特性が認められました。FMR1 および C9orf72 のピークから、いずれも 2-sec インジェクション、6 kV インジェクションおよびラン電圧、ならびに 3,300 sec（55 min）のラン時間を用いるベースモジュールとしての LongFragAnalysis の使用が保証されました。これらの条件は、3500xL 装置を使用した場合と同様のプロファイルを提供し、これに続く精度および感度の解析で使用されました（図1）。

マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅（Multiplex ligation–dependent probe amplification； MLPA）は、一つの遺伝子座のコピー数変異に起因するヒトの遺伝性疾患を研究するために広く使用されている方法の一つです。MRC Holland 社によって開発・商業化されたこの方法では、目的の遺伝子座にハイブリダイズする隣接プローブを最高 50 マルチプレックスペアまで解析できます。MLPA プローブアンプリコン解析には、高いダイナミックレンジ、サイジング精度、ピーク高フィデリティが必要になるため、SeqStudio システムは MLPA 解析の実行に理想的なプラットフォームとなります。SeqStudio 装置で得られる結果は、MLPA データ解析用の MRC Holland 社の Coffalyzer.Net ソフトウェアと互換性があります。

SeqStudio 装置での MLPA によって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）遺伝子のエクソン 2-30 の重複を有することが既知のプローブ由来 DNA サンプルおよび正常サンプルを、MRCHolland 社の P034 DMD アッセイセットで解析しました。これらのサンプルのピーク高および相対的サイズから、重複を含む領域の正確な検出が容易に行えました（図 1）。より大きな欠失および小さな欠失のためのプローブを使用した場合も類似の結果が得られました。このことから、SeqStudio 装置は CNV を含む領域の MLPA 解析用ツールとして利用可能であることが示されました。

 アプリケーションノート：SeqStudio Genetic Analyzer を用いた MLPA アッセイ

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ゲノムデータを容易に入手できるようになれば、「指紋」遺伝子座の DNA シーケンシングによって未知のサンプル中の生物種が同定できます。MicroSEQ キットなどの Applied Biosystems のキットは、リボソーム DNA（rDNA）配列のサンガーシーケンシングによって原核生物および真菌の同定を容易にしています同様に、真核生物もミトコンドリア特異的な遺伝子座を同定遺伝子座として使用することで同定できます。この戦略は Barcode of Life プロジェクトで活用されており（barcodeoflife.org を参照ください）、未知の真核生物サンプルの同定を迅速に確立する手段を提供しています。

微生物同定に関する SeqStudio Genetic Analyzer の性能を示すために、ATCC からさまざまな微生物のゲノム DNA サンプルを入手して Applied Biosystems MicroSEQ 500 PCR キットおよび SeqStudio 装置を使用したシーケンシングを実施し、得られた配列を BLAST データベースと照合しました。各シーケンシング反応に関して、正しい微生物が高い BLAST 信頼度で同定されました。同様に、魚ミトコンドリアシーケンス（CO1 遺伝子）用のプライマーと魚サンプルを使用した実験では、正しい魚種が最も高い BLAST ヒットとして同定されました。BLAST との照合で種が正しく同定されていることから、SeqStudio プラットフォームが極めて良好に種の同定に使用できることが示されました。

表 1.SeqStudio Genetic Analyzer による種の同定解析微生物 DNA サンプルまたは魚から抽出したゲノム DNA サンプルのシーケンシングを、16s rDNA 用のプライマーと MicroSEQ キット（BigDye Terminator v1.1 ケミストリ）、または魚ミトコンドリア CO1 配列用のプライマーと BigDye Terminator v3.1 ケミストリを用いて実行しました。

 アプリケーションノート：16S rRNA 遺伝子のサンガーシーケンシングによる微生物同定

一塩基多型（SNP）を検出する能力は、ゲノムが生物学的表現型にどのような影響を及ぼすかを理解するために極めて重要です。SNP の変異を解析するために、Applied Biosystems SNaPshot Multiplex System が開発されました。特定のアレルに対応する、カスタム化が可能でカラーコードされた異なるサイズのフラグメント解析が実行されます。SeqStudio システムには新しい特長として、サイズやピーク面積といったフラグメント解析結果のレポート機能の搭載など、SNaPshot 解析を容易にするための機能が含まれています。さらに、単一プレート上でフラグメント解析とシーケンシング解析を同時設定できるため、1 回のラン設定でSNPプロファイリングとサンガーシーケンシングが可能です。

SNaPshot ワークフローにおける SeqStudio 装置の機能的有用性を証明するために、腫瘍由来 FFPE サンプルからゲノム DNA を抽出し、KRAS G12X および G13X アレルをターゲットとするプローブおよび SNaPshot マルチプレックス試薬キットで解析しました。SeqStudio 装置の結果からは、この位置での異なるアレルの存在と正確なコールが明示されました（図 1）。ただし、SeqStudio 装置でアレルは正確に検出されるものの、他のプラットフォームと比較するとポリマーの化学的性質の違いのために全ピークの絶対的な移動がわずかに異なる場合があります。このため、アレルとピークを明確に関連付けるために大規模な解析前には既知のアレルを使用したキャリブレーションの必要があります。