CRISPR 기술 정보

혁신적인 CRISPR-Cas9 기술은 유전체 편집 분야에 혁신을 일으키고 있습니다. CRISPR-Cas9 시스템은 유연성있고 특이적인 타겟 설정을 달성할 수 있으며, 줄기 세포 공학, 유전자 치료, 조직 및 동물 질병 모델, 공학적 질병-내성 형질전환 식물 등의 폭넓은 응용 분야에서 유전체 편집을 위한 강력한 도구로 사용할 수 있도록 수정 및 재조정할 수 있습니다. Thermo Fisher Scientific의 전문가는 고객에게 유전자 편집을 시작하거나 지속적 연구 개선에 대한 확신을 제공하기 위해 이러한 리소스 컬렉션을 마련하였습니다.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR) 및 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시스템은 세포의 유전자 염기서열을 직접 변경할 수 있는 간단하고 빠르며 효율적인 방법입니다. 간단한 박테리아 면역계 구성요소에서 유래된 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 다양한 세포에서 타겟 유전자 분할 및 유전자 편집이 가능합니다.

CRISPR-Cas9 시스템에서 endonuclease cleavage specificity은 RNA 염기서열에 의해 유도되기 때문에 가이드 RNA(gRNA) 염기서열을 조작하고 Cas9 endonuclease와 함께 타겟 세포에 제공함으로써 사실상 모든 유전체 자리를 편집할 수 있습니다.

CRISPR-Cas9 시스템은 짧은 non-coding gRNA와 Cas9 nuclease로 구성됩니다(그림 1). gRNA에는 타겟 특이적 CRISPR RNA(crRNA)와 보조 trans-activating crRNA(tracrRNA)라는 두 가지 분자 구성요소가 있습니다. gRNA 유닛은 Cas9 단백질을 특정 유전체 자리에 유도합니다. 여기서 Cas9 nuclease가 특정 유전체 타겟 염기서열에서 이중 가닥 절단을 유도합니다(그림 2).

박테리아에서 CRISPR 자리는 spacer로 불리는 exogenous DNA(길이: ~30 bp) segment로 분리된 일련의 반복 구성입니다. Repeat-spacer array는 긴 precursor로 전사되고 반복 염기서열 내에서 처리되어 Cas9 nuclease가 분할한 타겟 염기서열(protospacer라고도 함)을 지정하는 작은 crRNA를 생성합니다. 그런 다음 CRISPR spacer를 사용하여 DNA 수준에서 exogenous 유전 요소를 인식하고 silencing합니다.

중요한 점은 분할이 발생하려면 타겟 영역의 3’ 말단을 즉시 다운스트림하는 특정 3-nucleotide 염기서열이 존재해야 한다는 것입니다. 이는 protospacer adjacent motif (PAM) 염기서열이라고도 합니다. 이 PAM 염기서열(Cas9용 NGG)은 타겟 DNA에 있지만 이를 표적화하는 gRNA에는 없습니다.

CRISPR-Cas9를 사용한 DNA 분할에 이어 이중 가닥 절단도 세포의 자연 복구 메커니즘의 두 가지 측면 중 하나로 복구할 수 있습니다(그림 3).

1. Repair template이 없는 경우, nonhomologous end joining(NHEJ)으로 인해 gRNA 한정 절단 주변의 다른 삽입 또는 결실(indel) 세포의 이종 모집단이 생성됩니다. 이러한 과정으로 인해 특정 염기서열에 따른 무작위 indel로 세포주를 생성하여 기능적 knockout을 생성할 수 있습니다.
2. 또는 repair template이 제공되는 경우, 사용자 정의 염기서열 변경은 오류가 없는 homology-directed repair(HDR) 메커니즘을 통해 유전체 내 특정 자리에 유도될 수 있습니다. 이 과정은 새로운 유전자를 과발현하거나, 질병 관련 세포 모델을 생성하거나, 보고 가능한 부분으로 endogeneouos 유전자를 태깅하는 데 사용할 수 있습니다.

유전자 편집 워크플로우를 위해 CRISPR-Cas9 선택 시 이 시스템을 사용한 유전체 편집 효율에 영향을 미치는 요소를 이해해야 합니다. 분할에 사용되는 nuclease 형식 및 gRNA, 세포에 분자를 가장 효과적으로 전달하는 transfection 방법, 결과에 대한 적절한 검증을 위해 유전자 편집을 검출하는 데 필요한 assay 등을 포함하여 실험 설계를 고려하는 것이 중요합니다.

Thermo Fisher Scientific은 유전체 편집 시약 제품군을 제공합니다(그림 4). 이 유전자 편집 솔루션은 애플리케이션 및 세포 유형에 따라 최적의 세포 배양 시약, 전달 방법, 분석 도구와 함께 사용할 수 있습니다.