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分步分离和分析 MHC 相关肽
免疫组学涉及主要组织相容性复合体 (MHC) I 类和 II 类分子在细胞表面呈递的肽的鉴定和表征。T 细胞受体可识别这些肽，并在免疫识别和抗原递呈中发挥着关键作用。
免疫 原型样品制备包括表征和识别该圆顶的几个关键步骤。收集细胞或组织并通过 MHC 特异性抗体，通过免疫沉淀 (也称为免疫亲和纯化或 IP) 分离 MHC 相关肽 (MAP)。通过质谱分析 (MS) 分析进行肽表征，比较 MHC 呈递的未知肽与蛋白序列数据库以鉴定和定量肽抗原。
免疫的提示和挑战研究
分离与 MHC 分子相关的肽以及使用质谱分析的后续分析是表征免疫圆顶的有价值技术，然而免疫母体研究的涉及一些独特的挑战。通过遵循这些有用的提示，帮助确保免疫主导实验的成功。
| MHC 相关肽的丰度较低 | 使用大量细胞或组织样品。在免疫沉淀程序中避免肽损失：
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| 免疫肽的复杂性和多样性 | MHC 相关肽不是通过蛋白酶裂解产生的：
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步骤 1：制备 MHC 免疫沉淀柱
免疫的染色实验中用于 IP 的抗体
| MHC Class I | MHC Class II | |
| 人 HLA I 类抗原由 HLA-A ， HLA-B 和 HLA-C 分子代表 | 人 HLA II 类抗原为 HLA-DR ，包括 DP ， DQ ， DR2 ， DR3 和 DR4 分子 | |
| 抗 Pan MHC 或类别特异性抗体 | HLA-DR 单克隆抗体 (W6/32) 通常用于已发表的免疫占比实验，后者可与人 MHC I 类反应，包括 HLA-A ， HLA-B 和 HLA-C | MHC II 类单克隆抗体 (M5/114) 可与小鼠 MHC II 类分子反应 |
| 等位基因特异性抗体 | HLA-DR (MHC I 类) 单克隆抗体 (BB7.2) | HLA-DR (MHC II 类) 单克隆抗体 (L243) |
| H-2kb (MHC I 类) 单克隆抗体 (Y-3) | HLA-DR (MHC II 类) 单克隆抗体 (NKI (SPV) L3) | |
| H-2dB (MHC I 类) 单克隆抗体 (B22-249.R1) | I-A/I-E (MHC II 类) 单克隆抗体 (M5/114.15.2) |
需要更多的抗 MHC 抗体？
选择抗 MHC 抗体的纯化支持物
纯化支持物包括表面具有蛋白 A ， G 或 A/G 的磁性和琼脂糖微珠。蛋白 A 和 G 是 与完整 Ig 抗体的 Fc 部分结合的免疫球蛋白 (Ig) 结合蛋白，有助于将微珠偶联至抗 MHC 抗体。一般而言，琼脂糖微珠可提供更高的结合能力，而磁珠可实现更快和更高通量的使用自动磁性纯化系统进行免疫沉淀实验，如 KingFisher 样品纯化仪器。如果选定的抗体类别与蛋白 A 或 G 的结合力不好，也可以将包被链霉素亲和素的磁珠和琼脂糖微珠用于连接生物素化抗体
常见的免疫亲和纯化树脂和形式 *
| 产品规格 | Dynabeads 和 Pierce 磁珠 | Agarose/Sepharose beads |
| 特点和优势 |
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| Protein A products | ||
| Protein G 产品 | ||
| Protein A/G products | ||
| Streptavidin products | ||
| Reactive products |
* 这些产品并非所有都在免疫方案实验中验证了肽纯化。请参阅已发布的免疫方案，以获得产品选择和使用指南。
需要更多纯化树脂？
用于 IP 的交联剂和共价结合方法
| 独立的交联剂 | 交联免疫沉淀试剂盒 | 活化蛋白固定支持物 | |
| DSS（双琥珀酰亚胺辛二酸酯） | DMP（二甲基吡咪酯） | ||
| 包含一个胺反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）酯在一个 8-carbon 隔臂的每一端 | 包含一个胺反应性酰亚胺酯基团在一个7-atom间隔臂的每一端 | 含有结合抗体的蛋白 A/G 磁性或琼脂糖微珠。然后使用 DSS (辛二酸二琥珀酰亚胺酯) 使抗体与微珠交联。 |
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步骤 2：裂解细胞或组织样品以进行图谱提取
将细胞或组织裂解，以将 MHC 分子 - 肽复合物释放到溶液中，从而进行进一步纯化。可提供各种细胞裂解和蛋白提取试剂，专为不同的样品类型和下游应用而定制。为了帮助确保肽的完整性，在裂解过程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以帮助防止肽降解。裂解后，通过离心清除细胞裂解物，并进行蛋白定量，以在进行 MHC 复合物的免疫沉淀之前确定存在的蛋白量。
| 细胞和组织裂解试剂 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | |
| 优化试剂 | 免疫学出版物中使用的独立去垢剂 | |
| Pierce IP 裂解液 含有 NP-40 的细胞裂解缓冲液，并针对免疫沉淀检测进行了优化 |
| 停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒，无EDTA（100X） 与质谱分析兼容，因为它不含干扰组分 |
| M-PER 哺乳动物总蛋白提取试剂 含有用于总蛋白提取的温和，非变性去污剂的细胞裂解缓冲液 | ||
| Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒 用于提取膜蛋白的细胞和组织裂解试剂 | ||
裂解物清除和定量：
- 通过离心清除裂解物
- 使用 BCA 测定对裂解物进行总蛋白定量
- 通过在无抗体的情况下与免疫亲和纯化支持物一起孵育，以去除高丰度蛋白并减少非特异性结合，从而预清除裂解物
步骤 3：采用免疫沉淀纯化图谱
MHC I 类或 II 类分子及其相关肽，使用 MHC 免疫沉淀和免疫亲和柱从细胞和组织裂解物中分离出来。然后，使用酸洗脱从微珠中洗脱 MHC- 肽复合物，释放分离的复合物并从 MHC 分子中分离肽。
进行 IP 以分离 MHC- 肽复合物
免疫沉淀 和免疫亲和纯化涉及以下步骤：
- 结合—与裂解物结合，抗体 - 微珠与裂解物结合，使 MHC- 肽复合物与抗体 - 微珠支持物结合
- 清洗—通过离心或放大倍数采集磁珠，然后通过洗涤去除未结合的样品组分
- 洗脱—用 1% TFA 洗脱磁珠上的 MHC 分子和肽，从 MHC 分子中分离出肽
执行免疫沉淀程序时，请遵循抗体和免疫亲和纯化支持物生产商的指南以及已发表的方案。
从 MHC 分子分离肽
在肽的质谱分析之前，通过分子排阻色谱法或固相提取，分离并去除 MHC 分子以纯化释放的肽抗原。为了充分分离并制备肽以用于 MS 分析，通常需要两轮固相提取，并可包括离线肽脱盐或反相高效液相色谱 (RP-HPLC) ，随后是 LC-MS/MS。用 5-10 kDa 的截止滤光片进行的 MWCO 过滤也可用于从较大的 MHC 分子 (~30-46 kDa) 分离较小的肽 (MHC I 类肽的 ~8-11 氨基酸和 MHC II 类肽的~12-25 氨基酸)。
| 尺寸排阻色谱产品 | 固相萃取产品 | |
| 蛋白浓缩管 | 用于质谱分析的C18柱和肽脱盐 | RP-HPLC仪器和色谱柱 |
| 皮尔斯蛋白浓缩器，3K MWCO，100–500µL | 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 系统 | |
| 反相 HPLC 色谱柱 | ||
| C18 反相 HPLC 色谱柱 | ||
步骤 4：使用 MS 发现并表征图谱
谱图一旦与 MHC 分子分离，使用高效液相色谱结合串联质谱 (LC-MS/MS) 进行分析。靶向和发现 质 谱分析工作流程都用于免疫。
- 发现质谱分析—可以全面鉴定和表征 MHC 分子呈递的肽。这种无偏倚方法有助于发现新肽并了解 MHC 肽库的广度。
- 靶向质谱分析—用于精确定量感兴趣的特定肽抗原。该方法通常应用于验证和定量 MHC 分子呈递的已知肽。
用于免疫肽分析的质谱定量方法
| 量化法 | 技术 | 特点 | 用途 |
| 相对 | 无标记定量（LFQ） | 已比较样品单独对其进行检测和分析 | 用于发现 (非靶向) 蛋白质组学应用 |
| 使用 TMT (串联质谱标签) 进行同量异位标记 | 使用同量异序质量标签在单次分析中对多达 18 份样品进行多通路定量 | ||
| 使用 SILAC 进行代谢标记 (细胞培养氨基酸稳定同位素标记) | 在存在含重同位素或轻同位素标记氨基酸的培养基中培养的细胞，并与轻量比进行比较 | ||
| 绝对的 | 重标记的内参标准品 | 将合成，稳定同位素标记 (SIL) 肽标准品添加到样品中，并通过将内源性 (轻) 肽 的信号强度与 HeavyPeptide AQUA 定制肽等合成肽标准品 (重) 进行比较来进行定量 | 用于发现 (非靶向) 蛋白质组学应用，用于质量控制和靶向定量蛋白质组学应用 |
步骤 5：验证地图
一旦确定图谱， 即可使用质谱法进行靶向定量，用于验证肽抗原。靶向定量涉及含已知量稳定同位素的合成肽样品加标，此类合成肽可作为 MHC 肽抗原定量的内标。 使用 SureQuant 靶向质谱分析采集试剂盒和试剂 进行 SureQuant 靶向定量可以使用绝对或相对定量模块对靶肽进行定量，其中包括系统适用性标准品和 AQUA Ultimate 重和 / 或轻肽混合物。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.