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氢氘交换 (HDX) 质谱法
利用氢氘交换质谱法阐明蛋白质构象、结构及动力学
HDX-MS 实验方案利用了蛋白质主链酰胺上存在的质子的不稳定性质，它是研究蛋白质结构的强大工具。当溶解在溶液中时，蛋白质将这些质子与氘化缓冲液中存在的氢基团交换，而蛋白质中的质子则与氘交换。仅测量主链酰胺上存在的质子。氢与氘交换的速率提供了溶剂可及性数据，可用于推断有关蛋白质结构和构象的信息。质谱法可用于测量氘摄取的速率。
HDX-MS 分析可用于获取有关结构、蛋白质-蛋白质或蛋白质-配基相互作用位点、变构效应、内在无序以及由翻译后修饰 (PTM) 引起的构象变化的信息。HDX-MS 的优势在于不受蛋白质或蛋白质复合体大小的限制，而且它具有较高的灵敏度，可以检测出共存的蛋白质构象。
本页内容
HDX-MS 的工作原理是什么？
所有 HDX-MS 实验都需要在 MS 分析之前进行氘标记。蛋白质在氘缓冲液中孵育，使得存在于蛋白质主链上的酰胺氢能够与氘缓冲液交换。最常用的标记方法是持续标记，在该方法中，将处于稳定状态的蛋白质在不同时间段内在氘缓冲液中连续孵育，并将氢与氘的交换作为时间的函数进行测量。时间段可以从几秒到几小时或几天。标记后，将实验温度降至 0°C 并将反应的 pH 值降至 2.5 以猝灭样品。HDX-MS 实验可采用自下而上或完整/自上而下的方式进行。
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白皮书：应用于质量分析的氢氘交换质谱法
HDX-MS 是研究蛋白质结构、动力学、折叠、复合体和相互作用的强大工具。本文将介绍 HDX-MS 的优势、所提供的信息及其与传统技术的互补作用、硬件和软件的近期创新，以及为简化 HDX-MS 而开发的工作流程。
HDX-MS 工作流程
鉴定
HDX-MS 最常用的策略是将蛋白质酶解成肽段，然后使用质谱法对其进行分析。这可以确保完整的序列覆盖率，并从蛋白质中捕获特定区域信息。在进行氢-氘交换之前，使用多种裂解技术以数据依赖的方式酶解和分析蛋白质：碰撞诱导解离 [CID]、高能碰撞解离 [HCD] 和电子转移解离 [ETD]。
目的是鉴定尽可能多的重叠肽。这是为了尽可能提高待鉴定蛋白质的序列覆盖率。在该过程之后紧接着进行 HDX-MS 实验。在 HDX-MS 实验中使用低 pH 值可较大程度地减少氘的反交换，因此胃蛋白酶等酸性酶是酶解的首选。酶解可以在溶液中或固定的胃蛋白酶色谱柱上进行，后者是首选方法。
当前可用的商业平台，例如 H/D-X PAL 氢氘交换采样器系统 (LEAP Technologies)，可实现自动标记和酶解。酶解后，样品在捕获柱上脱盐并使用反相色谱法进行分离，然后进行质谱分析。
氘摄取信息
HDX-MS 实验可以通过两种方式进行。第一种方法是采集全扫描 MS，以获得关于肽水平的氘摄取信息，探测蛋白质构象。第二种方法是获取更高分辨率的氨基酸水平信息，因此需要采集肽片段水平上的氘摄取数据。在此，为未标记样品和氘化样品采集全扫描 MS 和数据依赖性 ETD MS2。通过此设计，全扫描 MS 实验确定了肽水平的氘掺入值，而分辨率更高的单一氨基酸水平氘掺入值则通过 ETD MS2 获得。在这种情况下，ETD 优于 CID 或 HCD，以避免氘加扰，这是采用能量驱动碎裂方法时的一种已知现象。
在加扰过程中，肽主链上的质子发生迁移，且不反映溶液中肽的状态。研究表明，ETD 是一种非遍历性裂解技术，由于该过程中发生的氢加扰水平极低，使其更适合作为活化选择；因此，ETD 可实现在单个残留物分辨率水平上准确定位掺入的氘。
自下而上 HDX-MS 的替代选择是完整/自上而下的分析。在完整/自上而下的 HDX-MS 中，蛋白质在氘交换后被引入质谱仪，无需任何酶解。对于复杂的混合物，在将蛋白质引入质谱仪之前进行一定程度的分离，通常使用 C4 色谱柱。可以在完整水平上测量氘摄取，或者可以使用 ETD 对蛋白质进行测序。
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HDX-MS 工作流程的适用产品
H/D-X PAL 氢氘交换采样器系统 (LEAP Technologies)
H/D-X PAL 自动采样器具有带注射器更换功能的单头，配备独立的胃蛋白酶柱室以提高肽覆盖率和封闭的样品仓以稳定所有样品瓶的温度。 冷却样品仓内灵活的 3 阀配置可实现高效的样品净化。Chronos 软件为方法定制和 Thermo Scientific Xcalibur 软件的完全集成提供了完整的编辑功能。
Acclaim 5μm PepMap™ 300 μ-Precolumns 柱芯色谱柱
Thermo Scientific Acclaim 5μm PepMap 300 μ-Precolumns 柱芯色谱柱是非常短的微柱，由一组一次性柱体组成，目前可从
使用 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 LC 色谱柱对胰蛋白酶肽、天然肽和合成肽进行高分辨率肽图分析。这些色谱柱通常用于蛋白鉴定、生物标记物发现和系统生物学的 LC-MS/MS 肽图分析。Acclaim PepMap 100 C18 色谱柱载样能力高，因此非常适合分析复杂蛋白组学样品中的低丰度肽。大多数 C18 色谱柱都预先组装了 Thermo Scientific nanoViper 手拧接头，可实现轻松安装。另外也可提供传统色谱柱。
借助 Thermo Scientific Hypersil GOLD HPLC 色谱柱，您可在 HPLC 和 LC/MS 应用中获得出色的峰形和分离度。这些封端、超纯、硅胶色谱柱借助通用梯度和 C18 选择性，可显著减少峰拖尾。凭借卓越的分离度、效率和灵敏度，Hypersil GOLD 色谱柱可使您对分析数据的准确性和质量充满信心。
Vanquish Neo UHPLC 系统是纳流、毛细管流和微流液相色谱分析新标准。Vanquish Neo UHPLC 系统专为追求科学新突破的研究人员而设计，是蛋白质组学、精准医学、转化研究等领域 LC-MS 应用的理想选择。与 Thermo Scientific PepMap Neo 纳流 LC 色谱柱相结合，可为浅梯度、高通量应用以及介于两者之间的各类应用提供出色的效率和强劲的性能。
Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 质谱仪提供特异性所需的高分辨精确质量数 (HRAM) 以及必要的短梯度运行，以防止反向交换并实现氘掺入的精确测量。高质量 Orbitrap DDA 谱图与 Thermo Scientific BioPharma Finder 软件相结合，可确保对所有肽段进行可靠且快速的鉴定
Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪提供了扩展实验范围的较大灵活性，并具有内置智能，可确保 HDX-MS 实验的极高数据质量。该质谱仪提供了特异性所需的高分辨精确质量数 (HRAM) 以及必要的短梯度运行，以防止反向交换并实现氘掺入的精确测量。多种裂解技术、CID、HCD 和 ETD 可用于识别尽可能多的重叠肽，从而实现蛋白质鉴定的较大序列覆盖率。此外，该质谱仪通过 ETD 碎裂提供较高精确度，可实现将氘交换定位到氨基酸水平。
Thermo Scientific BioPharma Finder 软件支持所有 HDX-MS 数据分析，包括肽鉴定、PTM 分析和 HDX 独特的保护因子图，可以在单个残留水平上进行分析。
通过 HDX-MS 获得的信息类型
蛋白质或蛋白质复合体可具有多种三维形状，称为构象。HDX-MS 可以提供有关蛋白质或蛋白质复合体不同状态之间构象差异的信息，并且可以帮助阐明蛋白质的结构化区域与非结构化区域。
蛋白质或蛋白质复合体可能会引起构象变化，从而形成新的三维结构；这称为蛋白质动力学。HDX-MS 可以提供有关各种短暂的中间结构以及从一种状态到另一种状态的一系列事件的信息。
生物分子结合的过程提供了不同亚基或配基之间相互作用关系的信息。蛋白质和其他蛋白质之间或蛋白质与配基（如核酸、脂类、聚糖和小分子）之间可能发生相互作用。可以确定参与结合的蛋白质位点的位置以及配基结合如何影响蛋白质构象。
HDX-MS 提供有关配基结合对蛋白质位点而非结合位点或整个蛋白质的影响的信息。
该过程提供了关于缺乏三维结构的蛋白质的信息。这可以是作为柔性多肽或环肽存在的整个蛋白质或蛋白质的一部分。
HDX-MS 提供了蛋白质聚合、构象变化和聚集过程中形成的中间结构所涉及的区域的相关信息。