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Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪
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探索 Thermo Scientific Orbitrap Tribrid 技术的最新创新，该技术可实现行业领先的性能，同时为所有经验级别的用户提供实验多功能性和可用性。
深入了解 Orbitrap Eclipse 质谱仪
Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪基于突破性的 Orbitrap Tribrid 架构，带来强大的多用途质谱分析解决方案，可帮助您准确解析细微差异、从众多错误答案中辨别正确答案，并避免进入代价高昂的死胡同。
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高容量传输管 (HCTT)增加进入质谱仪的离子通量 | 电动离子漏斗在 HCTT 之后聚焦离子 | EASY-IC/ETD/PTCR 离子源基于 Townsend 放电；可靠且易于使用 | 先进的主动离子束导向防止污染物进入质量分辨四极杆 | QR5 分段式双曲面四极杆质量过滤器在 0.4 m/z 前体离子隔离宽度内提高灵敏度 |
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超高场 Orbitrap 质量分析仪提供 >500,000 FWHM 的分辨率（可选 1,000, 000 FWHM）和高达 40 Hz 的 MSn 采集速率；启用 TurboTMT 和 HMRn | 超高真空 (UHV) 歧管降低 UHV 区域中的压力；改善 Orbitrap 质量分析仪中的离子检测 | 多极离子通道实现更高的采集速率；在任何 MSn 阶段执行 HCD；允许可变压力 (0.5–20 mTorr) 以实现优异的自上而下性能 | 实时检索提供实时多肽鉴定，从而提高 TMT 定量的深度和准确度 | 改进的双压线性离子阱在离子阱和 Orbitrap 质量分析仪中启用 MSn 进行离子检测；多裂解模式的高灵敏质量分析：CID、HCD、ETD/EThcD/ETciD 和 UVPD；以及前体离子分离用于 HMRn分析。高压室的前部加长，改善了对 ETD 和 PTCR 反应的控制。 |
单细胞蛋白质组学分析
单细胞蛋白质组的综合性表征可以提供大量疾病进展背景下细胞发育和根据细胞类型对治疗的反应的新信息。然而，由于该实验要求的分析灵敏度，单细胞分辨率的蛋白质组分析仍然是一项巨大挑战。开发了 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪，能够从超低水平样品（包括单个细胞）中提取无可匹敌的定量数据。
基于 MS3 的串联质谱标签 (TMT) 方法通过实时检索功能得到增强，可提供实现蛋白质组覆盖率的通量和灵敏度以及区分细胞类型并捕获其异质性所需的定量准确度。此外，使用新型 Thermo Scientific TMTpro 16plex 标签试剂盒，可在一次 LC-MS 运行中分析多达16个单细胞，从而对各单个细胞中的数千种蛋白质进行定量比较。
使用 FACS 分选仪分离单个细胞，标记并使用 Orbitrap Eclipse 质谱仪进行分析
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采用实时检索的新型 MS3 工作流程在每个单个细胞中检测到超过300种差异表达蛋白
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与基于 MS2 的实验相比，当使用采用实时检索的 SPS MS3 时，两种细胞类型的 TMT 分析显示出更多的差异表达蛋白。MS3 实验可进行更加准确的定量，从而能够检测各单个细胞中更多蛋白质的细微变化。
采用实时检索的 SPS MS3 实验对单细胞进行高分辨率分类
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每种类型单个细胞中已知蛋白生物标记物的过表达的确认强调了工作流程的灵敏度
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显示使用 TMT 数据对三种细胞类型进行无监督分类的 PCA 图。每个点对应于单个细胞的蛋白质表达。该图显示了各种细胞类型的明确分类并分离了每种类型的异质性。通过将 TMT-boost** 和带实时检索数据采集技术的 SPS MS3 联用，可以实现这一独特的分辨率水平。
* 有关 TMT 和实时检索的详细信息，请参见下文
** Budnik et al., Genome Biol.2018,19(1); Zhu et al., 2018, Nature Comm., 2018, 9(882).
*** 本研究共分析了40个单个细胞。
"单细胞蛋白质组学的革命刚刚开始。通过将 nanoPOTS 及 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪、TMT 试剂与采用实时检索的 SPS MS 3 相结合，我们即可获得推进这一新生领域发展所需的覆盖深度、定量准确度和通量。”
犹他州杨百翰大学 Ryan Kelly 教授
手册：实现突破——利用有限的样品进行单细胞蛋白质组学分析
在赛默飞世尔科技，我们很自豪能够与生命科学创新者合作，他们正在改变人类健康的未来。创新每一天。
实时检索如何与 TMT SPS MS3 配合使用
蛋白质丰度的高通量定量比较的标准是 Orbitrap Tribrid 质谱仪独有的 TMT SPS MS3 工作流程。Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪的一项重大进步是实时检索1，可用于实时鉴别肽谱，以智能地指导 MS3 数据采集，每次可进行多达16个样品的LC/MS 分析，且通常达到准确定量到超过8,000个蛋白质的深度。
这种新的高通量工作流程提高了蛋白质组的覆盖范围，提高了准确度和精确度，增加了可量化的低水平肽的数量。
1.Erickson et al.J Proteome Res.2019, 18(3).
样品制备
LC/MS 分析
多通路 TMT 样品的基峰提取离子色谱图。以下 LC-MS 分析图像中的阴影区域突出显示了选定的质谱谱图。
前体离子质谱谱图
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当分析复杂的多肽混合物时，尽管使用较窄的前体离子隔离窗口，但仍可能发生共流出离子干扰。目标前体离子和干扰离子的共裂解会对基于 TMT 的实验的定量准确度产生负面影响。2
2.Ting et al.Nat. Methods, 2011, 8(11).
MS2
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在采集下一次 MS2 扫描的同时，使用实时检索针对每个 MS2 谱图与选择的数据库进行匹配查询。如果检索得到肽段匹配，则指导仪器仅以携带 TMT 标签的匹配碎片离子进行 SPS MS3 扫描，同时避免任何可能来自干扰离子的碎片。对于 YLYEIAR，仅在 N 端发现 TMT 标签，因此仅在五个 b 离子上执行 SPS MS3。
实时检索数据采集策略中，MS3 扫描的触发是仅当从之前的 MS2 中鉴定到肽谱匹配 (PSM) 时。这样就减少了 MS3 事件的数量，提高了前体离子采样率，并产生更多定量多肽；提高了实验速度。
与经典的 SPS MS3 实验相比，使用实时检索时，定量的多肽多 38%，蛋白质多 53%，接近经典 MS2 实验的结果，但精确度和准确度要高得多。此处显示的是 TKO 酵母标准品（赛默飞世尔科技）的数据。
实时检索指导质谱仪仅对确定的前体离子执行 MS3。因此，它可将 SPS MS3 实验的通量翻倍。此处显示的是 HHM 样品的数据：3种在 10plex (3-3-4) 中标记为生物重复样品的人类细胞系。（数据由哈佛医学院的 Devin Schweppe 和 Qing Yu 提供）
对于每个 TMT 通道，在 4-100 pmol 的六种蛋白酶解物中加入 40 µg HeLa 酶解物中，然后标记，得到以 2-24（2、4、8、12、16和24）的比率混合的加标标准品。此处只显示预期比率为2和24的合并平均值。实时检索提供的更高准确度对于梳理蛋白质丰度的细微差异不可或缺，包括在细分单个细胞时。
"Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪具有多种激动人心的进步，使我们的分析速度提高了 100%，定量准确度也显著提高。我们现在可以在18小时内完成一次典型的全蛋白质组分析，无需36小时，可在多达16个样品中定量8,000到10,000种蛋白质。这种新的质谱仪就像两台仪器一样，可在一半的时间内收集更准确的数据，但深度相同甚至更好。”
马萨诸塞州哈佛大学 Steven P. Gygi 教授
治疗性蛋白质的非变性分析
治疗性蛋白质成功用于治疗各种癌症和多种自体免疫疾病。然而，它们的结构表征面临着巨大的挑战，因为与小分子药物不同，它们是含有大量修饰蛋白质变体的多相混合物。通过增加分析物 m/z，可以简化其高度复杂的 ESI 谱图并使其可解析。这可以通过在未折叠蛋白质接受更少电荷的天然条件下执行 ESI LC-MS 实验，或在质谱仪中减少前体离子电荷，或通过两者结合来实现。为了实现完整的结构表征，质谱仪不仅需要检测更高 m/z 范围内的离子，还需要高效裂解所选前体离子。Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪配备高质量数范围 MSn (HMRn)、质子转移电荷减少 (PTCR) 以及各种解离技术，包括 CID、HCD、ETD、EThcD 和 UVPD，使其成为可用于综合性表征治疗性蛋白质的强大系统。
通过 PTCR 简化高度复杂的谱图
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唾液酸酶处理后含6个 N-连接糖基化位点的完整脱盐细胞因子 Fc 融合蛋白的天然 MS 谱图。由于存在多个重叠糖基化蛋白质变体，原始谱图高度复杂，难以解读。突出显示的 80 m/z 窗口代表分离用于后续 PTCR 的前体离子。
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PTCR 将选择的离子群分散到较高的 m/z 范围，以较低电荷状态揭示单个分子离子种类。对这一谱图的解释提供了关于不同蛋白质变体混合物的准确信息，这些蛋白质变体在原始谱图中是无法破译的。
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对所示 PTCR 谱图进行去卷积后（ReSpect™ 算法），鉴别出细胞因子 Fc 融合蛋白的几种糖型。对整个天然电荷状态包膜 (m/z 4,000–7,000) 进行 PTCR 分析，鉴别出该蛋白质的 > 30种不同糖型（数据未给出）
实现 CDR3 结构域的高序列覆盖率
Orbitrap Eclipse MS 上提供多种解离技术可以提供有关一级序列的互补信息，导致 CDR3 基序 100% 覆盖，增加抗体表征的可信度，并提供在蛋白质变体水平上其与不同抗原的反应性的深入见解。
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使用 HMRn 模式采集的天然谱图。27+ 种属显示了主要糖型的基线分辨率。
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27+ 母离子的代表性 MS2 谱图。该谱图是通过多种裂解技术获得的，并显示不同的碎片离子模式，提供互补信息并增加该蛋白质的伯氨基酸序列覆盖率。
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来自天然 HCD、ETD、EThcD 和 UVPD MS2 数据的完整曲妥珠单抗的组合裂解图谱。轻链和重链的序列覆盖率分别为 58% 和 36%，组合覆盖率为 43%（碎片离子 RMS 误差 <3.7 ppm）。轻链和重链的互补决定区 (CDR) 3 在图谱中分别以红色和蓝色突出显示，显示 100% 序列覆盖。CDR 序列的验证对于研究抗体结合亲和力和功效至关重要。
天然蛋白质-配体复合物的表征
配体与它们所结合的蛋白质的调节和功能密不可分。然而，鉴别与膜蛋白相关的小分子配体是一项重大的挑战，电子显微镜数据下未分配或分离不佳的配体密度的普遍存在凸显了这一点。在不丢失配体-蛋白质复合物关联的情况下直接进行配体的 MS 鉴别很困难，因为它需要非常宽的质量数范围，同时保留完整蛋白质组件（数十万道尔顿）的最佳离子传输并准确检测小分子配体及其片段（通常小于100道尔顿）。
Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪的高质量数范围 MSn 功能有助于鉴别与膜蛋白结合的配体，可阐明与特定蛋白质相互作用的特定配体。该方法有助于阐明配体对作为细胞机制基础的蛋白质相互作用级联的影响，包括癌症、糖尿病和阿尔茨海默病的机制。
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使用去污剂从膜中提取完整的蛋白质复合物。去污剂分子在蛋白质复合物周围形成胶束层，使其溶解。然后使用 nESI 对胶束进行电离，并将其引入质谱仪。
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使用源内CID 裂解（伪 MS2）从去污剂胶束释放完整膜蛋白-配体组件，并在 Orbitrap 质量分析仪中检测。分离含相关配体的 17+ 母离子（灰色条），用于下一 MSn 步骤。
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基于 MS3 的完整膜蛋白-配体组件的分离和活化促进配体的释放 (m/z 350.0)。这种单电荷离子分离（灰色条）用于 MS4 步骤，以实现完全的结构表征。（注：本实验中，在离子阱中 m/z 350.0 处检测到配体。Orbitrap 和线性离子阱质量分析仪均可用于检测整个 m/z 范围内的离子)。
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MS4 谱图包含在离子阱中检测到的配体片段。使用成熟的小分子表征技术，明确鉴别与蛋白质结合的内源性配体。在此，发现氨苄青霉素与大肠杆菌外膜孔蛋白 F (OmpF) 结合，形成介导其摄入的 111 kDa 蛋白质-配体复合物。也可以使用这种新型自上而下 MSn 方法进一步表征蛋白质的一级结构。
“Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪为天然 MS 带来了新的视角，使我们能够在一次实验中发现并通过化学方式定义调节膜蛋白组件功能的配体、脂质和药物。”
英国牛津大学 Joseph Gault 博士
使用 PTCR 降低蛋白质质谱复杂性
PTCR 形成了母离子的较低电荷状态分布，重叠较少，更容易解释。这使得在 3 m/z 范围的 PTCR 之后，可识别的前体离子的数量从最初的全扫描 MS 谱图中的两种增加到32种。新鉴别的质量分布在 10-70 kDa 范围内（见下方左侧的直方图）。
PTCR 阐明了新的蛋白质电荷状态分布
自上而下质谱分析用于直接表征完整蛋白质形态。即使在 LC 分离后，蛋白质形态混合物的 ESI 谱图复杂性通常也非常高，这是由于 m/z 区域中存在大量重叠的修饰形式。Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪独有的质子转移电荷减少 (PTCR) 技术可降低母离子分布的平均电荷，将其移至更高的 m/z。对于重叠无法区分的蛋白质形态，这可以减少信号重叠，因此可以获得更易于解读的谱图，从而能够进行蛋白质形态质量计算。对于自动化自上而下实验，这种方法可以增加数据依赖 MSn 可区分前体离子的数量，最终增加所表征的蛋白质的数量。
多种蛋白质形态的共洗脱增加了谱图复杂性，特别是在分析 >25 kDa 的蛋白质时。这些谱图通常无法完全解读，因为通过去卷积软件可区分的电荷状态分布很少（例如，在 25 min 时，在该 MS 谱图中仅鉴别出16和 25 kDa 的两个不同质量）。800–900 m/z 区域显示了潜在的谱图复杂性。在两个 1.5 m/z 窗口中对前体离子进行 PTCR，以灰色和青色突出显示。
PTCR 支持检测更多和更大的蛋白质变体
PTCR 导致所鉴定的蛋白质变体的数量显著增加*
Huguet, R. et al.Anal.Chem.2019, 91(24).
“需要 PTCR 来研究之前在 LC-MS 实验中无法表征的大蛋白质变体。揭示超过 30 kDa 障碍的完整蛋白质组的真正复杂性是蛋白质组学领域向前迈出的实质性一步。”
俄克拉荷马州俄克拉荷马大学 Luca Fornelli 教授
只需点击一下即可选择特定于应用的方法
直观的方法编辑器具有拖放式用户友好界面，并配有针对多种应用的预定义、优化方法模板。这使科学家能够为最常用的实验（如糖基化、代谢物、多肽鉴定、多肽定量、PTM、先进的 TMT、SureQuant 等）轻松生成高质量数据。
通用方法编辑器结合了仪器控制和数据采集参数，通过使用大量的常用实验模板，您可以从一开始就采集到高质量数据，或者使用拖放操作快速创建并直观显示您自己的实验。
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Thermo Scientific FAIMS Pro Duo 接口可扩展广泛应用的互补选择性、提高实验信噪比、扩展样品覆盖范围并极大限度地提高通量，同时减少耗时的样品制备步骤。
通过质谱法鉴定、表征和定量分析目标化合物依赖于从日益复杂的样品中采集高质量的 MS 和 MSn数据。FAIMS Pro Duo 接口通过气相分馏提高下一代质谱仪的分析性能，从而改善目标化合物类别的选择性。无论色谱流速或上样量如何，降低谱图复杂性并提高目标分析物的信噪比，即可获得更高的样品覆盖度和数据可信度。
通过 Thermo Scientific Easy-IC 离子源将质荷比 (m/z) 质量精度提高至 1 ppm 以下，该 Easy-IC 离子源还包含二次离子源，可将规定数量的校正离子输送至分析物离子。此功能可实时精确地调节仪器的 m/z 校正，纠正由于温度波动和各项扫描之间变化导致的未补偿误差。
Thermo Scientific 100万（M）分辨率
基于 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪的 100万（M）超高分辨率设置，分离同位素组分，获得精细的同位素信息，并实现小分子分析物元素组成的可靠鉴定。1M 分辨率选项通过获得超高分辨率质量测量值 (1,000,000 FWHM (m/z 200))，帮助表征和定量结构多样性目标化合物。
在 1,000,000 (1M) 分辨率设置 (m/z 200) 下获得的具有 2 s 循环时间的抗氧剂1035 质谱图。右侧面板显示了在 500,000 与 1,000,000 分辨率设置下采集的 A+2 同位素的精细结构。18O 和 2 13C 同位素可以使用具有 1M 的 Orbitrap Fusion Lumos 和/或 Orbitrap Eclipse 质谱仪进行分离。
客户评价：
即使在复杂混合物中也能实现对脂质、修饰肽段和完整蛋白质的明确表征，并且获得 CID、HCD、ETD 或 EThcD 无法获得的独特结构诊断信息（例如双键）。UVPD 将独特序列覆盖率增强了20%以上，在线性离子阱中生成可通过离子阱或 Orbitrap 质量分析器检测到的 MSn 碎片。
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