利用两种靶向同一蛋白靶标的独立抗体，可作为检测抗体特异性的有用工具。理想情境下，所用的两种抗体靶向抗原的不重叠表位。通过获取识别同一靶标蛋白的独立区域的抗体结果，可提高抗体具有特异性、适于检测预定靶标结论的可信度。独立抗体检测是我们用来验证研究用 Invitrogen 抗体的一种方法。

独立抗体验证的常见应用会获得类似的检测模式，适于多裂解物免疫印迹、IHC 芯片、多细胞系免疫荧光、免疫沉淀、流式细胞术及其它抗体应用。

理论上说，采用独立抗体的方法较为直接，但实际上很难预测。根据样本制备、缓冲体系、多蛋白复合物内的方向及其他可能影响蛋白确认的参数，样本间结果可能不同。因此，同一种或两种待测抗体之间的表位易接触性差异可能很大。为考虑这些并发因素的影响，我们还针对靶向同一靶标的抗体采用了多克隆-单克隆方法，以确认抗体特异性。单克隆和多克隆库均有可能表现出相同的检测图案，尽管我们可以预测出二者的灵敏度存在差异。

独立抗体验证数据

以下实例展示了我们使用独立抗体验证靶向特异性的操作方法。

在第一个实例中，分别采用两种独立的 ER α 抗体（一种多克隆抗体，一种单克隆抗体）分析来自于 ER α-阳性的 MCF7、T47D、SK-BR-3 细胞， ER α-阴性的 Hs578T 细胞的全细胞裂解物和细胞核提取物。多克隆抗体的免疫原是来自于人 ER α蛋白 C 末端的短链合成肽段，而单克隆抗体的免疫原则是来自于大肠杆菌(E. coli)内表达的人 ER α 蛋白 C 末端区域的 35 kDa 部分蛋白。种属反应性以及质谱分析结果的差异，表明这些抗体具有明显差异的靶标结合曲线，适于进行特异性确认。正如我们预计的那样，大多数 ER 阳性细胞系细胞核提取物之中的 ER α均在主条带中检测出。此外，两种抗体在细胞核组分的 ER α 富集图案相同，进一步印证了抗体特异性。

Western blot analysis of Estrogen Receptor
Western blot analysis of Estrogen Receptor

雌激素受体 (ER) 免疫印迹分析。将 20 µg 来自于制定乳腺癌细胞系的全细胞裂解物 (WCL) 或细胞核提取物 (NE) 、10 µL PageRuler 预染蛋白分子量标准（货号 26616）后，进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜（货号 88518）上，并采用含有 5% 牛奶的 TBST 在室温下至少封闭 1 小时。使用采用封闭缓冲液 1:500 稀释的 ER 多克隆抗体（货号 PA5-16440） 在 4°C 下振荡平台过夜孵育，然后采用 1:40,000 稀释的 HRP 偶联山羊抗兔 IgG 二抗（货号 31460）孵育后检测 ~43 kDa 处的 ER 。采用 SuperSignal West Dura 底物（货号 34075）进行化学发光检测。为检查各个泳道内上样的蛋白是否等量，采用 HDAC1 多克隆抗体（货号PA1-860，下图）孵育，印迹 检测到的内源性蛋白的分子量与 ER α或 ER β亚型一致。

雌激素受体 (ER) 免疫印迹分析。将 20 µg 来自于制定乳腺癌细胞系的全细胞裂解物 (WCL) 或细胞核提取物 (NE) 、10 µL PageRuler 预染蛋白分子量标准（货号 26616）后，进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜（货号 88518）上，并采用含有 5% 牛奶的 TBST 在室温下至少封闭 1 小时。使用采用封闭缓冲液 1:1,000 稀释的 ER 多克隆抗体（货号 MA5-13065） 在 4°C 下振荡平台过夜孵育，然后采用 1:40,000 稀释的 HRP 偶联山羊抗兔 IgG 二抗（货号 31430）孵育后检测 ~48 kDa 处的 ER 。采用 SuperSignal West Dura 底物（货号 34075）进行化学发光检测。为检查各个泳道内上样的蛋白是否等量，采用 HDAC1 多克隆抗体（货号PA1-860，下图）孵育，印迹 检测到的内源性蛋白的分子量与 ER α或 ER β亚型一致。

 

在另一实例中，采用两种独立的单克隆抗体分析β连环蛋白：小鼠单克隆β连环蛋白抗体克隆15B8，以及小鼠单克隆β连环蛋白抗体克隆6F9。如下所示，两种抗体在检测人、小鼠和大鼠β连环蛋白时均表现出了良好的相关性。值得关注的是，克隆 15B8 还检测出了非人源原代 COS7 细胞中的 β连环蛋白，而克隆 6F9 则未检测出同一裂解物之中的β连环蛋白。两种抗体的免疫原均为重组人β连环蛋白。

Western blot analysis of beta-Catenin
Western blot analysis of beta-Catenin.

β连环蛋白免疫印迹分析。将 50 µg 指定全细胞裂解物上样到 4–20% Tris-HCl 聚丙酰胺凝胶上后，进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用 5% BSA/TBST 封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的β连环蛋白单克隆抗体（货号 MA1-301）在 4°C 振荡平台上孵育膜，在 TBS/0.1% Tween 20 之中洗涤，然后采用 1:20,000 稀释的山羊抗小鼠 IgG HRP 二抗（货号 31430）孵育至少1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34080）进行化学发光检测。 

β连环蛋白免疫印迹分析。将 50 µg /孔指定全细胞裂解物上样到 4–20% Tris-HCl 聚丙酰胺凝胶上后，进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用 5% BSA/TBST 封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的β连环蛋白单克隆抗体（货号 MA1-300）在 4°C 振荡平台上孵育膜，在 TBS/0.1% Tween 20 之中洗涤，然后采用 1:20,000 稀释的山羊抗小鼠 IgG HRP 二抗（货号 31430）孵育至少1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34080）进行化学发光检测。

 

采用独立抗体确认法确认 Invitrogen 抗体的靶标特异性

通过独立抗体验证的 Invitrogen 抗体在搜索结果及相关产品页面上会显示“特异性通过验证”图标、在各个产品页面将会提供证明验证内容的数据。

*“验证”或类似的表达仅指用于功能测试的研究用途抗体，旨在确认该抗体是否可用于指定研究技术。它 不能确保产品经过临床或诊断用途验证。