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细胞处理抗体验证*
细胞处理是细胞生物学之中常用来分析蛋白不同生物学功能（从信号传导通路到细胞周期和凋亡调控）的工具。此类生物学工具也可用于确认抗体特异性。细胞处理检测是我们用来验证研究用 Invitrogen 抗体的一种方法。
细胞处理可根据目标蛋白的富集、去除或移位，进行抗体特异性验证。例如，在细胞周期之中丰度动态变化的蛋白，可通过特定的细胞周期抑制剂富集。通过细胞因子处理和信号传导通路激活，可以激活不同的转录因子，进而引起细胞核移位。随后即可采用抗体更轻松地（相对于同一细胞室内常发生的轻微动变化态）监测出移位活动。
在分析翻译后修饰 (PTM) 状态时，可将细胞处理和抑制剂结合使用，以证明特定激酶通过特定位点的磷酸化激活。此操作可采用磷酸特异性抗体和相应的对照物实现。
细胞处理验证数据
在下述实例中，采用诺考达唑进行细胞处理，同时采用 siRNA 进行基因敲低，以确认抗体的靶向特异性。在 G2/M 细胞周期停滞期间，富集丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 PLK1（又称 Polo 样激酶 1）。PLK1 出现在未处理或诺考达唑处理 U2OS 细胞的全细胞裂解物之中。同时采用非靶向对照 siRNA 或 PLK1 siRNA 确认抗体特异性。采用 GAPDH 作为上样对照。
图 1.PLK1 免疫印迹分析。先对非靶向对照或 PLK1 siRNA 转染的U2OS 细胞进行未处理或诺考达唑(100 nM, 48 h)处理，再将 25 µg U2OS 细胞裂解物上样到 4–20% Tris-HCl 聚丙酰胺凝胶上。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用含 5% 牛奶/0.1% Tween 20 的溶液封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的 PLK1 小鼠单克隆抗体（货号 MA1-848）在 4°C 条件下，在振荡平台上对膜进行探针标记。采用 TBS/0.1% Tween 20 洗涤膜，采用 1:20,000 稀释的抗小鼠 IgG HRP 二抗（货号 31430）孵育至少 1 小时。洗涤膜，然后采用 SuperSignal West Dura 底物（货号 34075）进行化学发光检测。
细胞处理还用于确认 IP 应用的抗体特异性。在本例中，采用抗乙酰化的赖氨酸的单克隆抗体，对未处理细胞或曲古抑菌素 A (TSA)处理细胞的全细胞裂解物中的赖氨酸-乙酰化蛋白进行免疫沉淀。采用一种乙酰化组蛋白 H3 (Lys9) 单克隆抗体检测乙酰化组蛋白 H3 (Lys 9) 在 TSA 处理响应时的富集情况，确认乙酰化赖氨酸单克隆抗体在免疫沉淀富集其预定靶标时的特异性。
图 2.乙酰化组蛋白 H3 (Lys9)免疫沉淀来自于未处理（仅 DMSO 处理）细胞，或采用 0.3 µM 或 3 µM 曲古抑菌素 A (TSA) 处理 16 小时的细胞的全细胞裂解物。取 500 µg 指定裂解物与 3 µg 乙酰化赖氨酸单克隆抗体（货号 MA1-2021）在 4°C 下过夜振荡孵育，形成抗原-抗体复合物。在 50 µL Protein A/G 琼脂糖（货号 20421）上捕获免疫复合物，反复洗涤，采用 5X Lane Marker 还原样本缓冲液（货号 39000）洗脱。在 4–20% Tris-HCl 聚丙酰胺凝胶上解析样本，转印到 PVDF 膜上，采用 5% BSA/TBS/0.1% Tween 溶液至少封闭 1 小时。采用 1:1,000 稀释的乙酰化组蛋白 H3 (Lys9) 单克隆抗体（货号 MA5-11195）在 4°C 下振荡过夜孵育，然后采用 TBST 洗涤，并采用 1:2,000 稀释的 Clean-Blot IP 检测试剂（货号 21230）孵育至少1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34087）进行化学发光检测。
在免疫荧光检测中，细胞处理还用于确认乙酰化赖氨酸单克隆抗体（左图）和磷酸化ATM (Ser1981) 单克隆抗体（右图）的特异性。如果未处理，HeLa 细胞仅显示轻微的细胞核染色。经过 TSA（左图）或喜树碱（右图）处理后，靶标蛋白细胞核染色强度大幅增加。该结果与其他应用（如免疫印迹）获得的检测结果关联性很好，因而确认了抗体特异性。
图 3.未处理 HeLa 细胞内（左图）和采用 0.3 µM 曲古抑菌素 A 处理 16 小时的 HeLa 细胞（右图）内的乙酰化蛋白荧光分析结果。采用含 0.1% Triton X-100 的 TBS 在室温下至少透化处理被福尔马林固定的细胞 10 分钟，然后在室温下采用 1% BSA 封闭 15 分钟。采用 1:100 稀释的乙酰化赖氨酸单克隆抗体（货号 MA1-2021）在室温下孵育细胞1 小时，采用 PBS 洗涤，然后和 1:400 稀释的 DyLight 488 山羊抗小鼠 IgG 二抗（货号 35502）一同在室温下孵育 30 分钟。采用 DyLight 554 鬼笔环肽（货号 21834）染色 F-肌动蛋白（红色）。采用 Hoechst 33342 染料（货号 62249）染色的细胞核合并图像显示在最下方图中。图片为来自于 Thermo Scientific ArrayScan 成像系统的 20 倍放大图。
图 4.未处理 HeLa 细胞内（左图）和采用 10 µM 喜树碱处理 4 小时的 HeLa 细胞（右图）内 pSer1981 上的磷酸化 ATM 的荧光分析结果（绿色）。采用含 0.1% Triton X-100 的 TBS 在室温下至少透化处理被福尔马林固定的细胞 10 分钟，然后在室温下采用 1% BSA 封闭 15 分钟。采用 1:1,000 稀释的磷酸化-ATM (pSer1981)单克隆抗体（货号 MA1-2020）在室温下孵育细胞1 小时，采用 PBS 洗涤，然后和 1:400 稀释的 DyLight 488 山羊抗小鼠 IgG 二抗（货号 35502）一同在室温下孵育 30 分钟。采用 DyLight 554 鬼笔环肽（货号 21834）染色F-肌动蛋白（红色）（最上方图）。采用 Hoechst 33342 染料（货号 62249）染色的细胞核合并图像显示在最下方图中。图片为来自于 Thermo Scientific ArrayScan 成像系统的 20 倍放大图。
采用细胞处理法验证 Invitrogen 抗体的靶标特异性
通过细胞处理法验证的 Invitrogen 抗体在搜索结果及相关产品页面上会显示“特异性通过验证”图标、在各个产品页面将会提供证明验证内容的数据。
*“验证”或类似的表达仅指用于功能测试的研究用途抗体，旨在确认该抗体是否可用于指定研究技术。它 不能确保产品经过临床或诊断用途验证。