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免疫沉淀-质谱联用(IP-MS)抗体验证*
免疫沉淀和质谱联用(IP-MS)，可用来确认抗体与预期靶标的特异性相互作用。在现有的抗体验证*方法中，这种方法的特别之处在于可以主动识别和定量纯化自样本的实际抗体靶标。与其他评估抗体特异性的技术（如，通过对基因敲除小鼠来源样本进行免疫印迹染色，确定某个消失的条带）不同，质谱法可以直接确定来源于样本蛋白的肽段序列。因此，IP-MS是确认抗体与预期靶标直接结合的首选方法。
IP-MS 抗体验证工作流程
IP-MS 抗体验证的总体工作流程如附图所示。首先选择需要分析的抗体，客户根据实际能力选择候选细胞系模型来表达感兴趣的目标蛋白。接下来，针对细胞裂解物进行优化的免疫沉淀，随后处理所得的 IP 洗脱样本并采用质谱法分析。最后，采用自定义的生物信息学分析软件处理所得的 MS 数据集。简而言之，这一过程包括：(1) 从阴性对照和背景中区分真正的阳性结果；(2) 通过将高丰度富集的靶标与脱靶蛋白相对比较，计算富集倍数情况，以评估直接 (IP) 和间接 (co-IP) 产物（参见后文）。
IP-MS 抗体验证工作流程
IP-MS 抗体验证数据分析
IP-MS 蛋白分组
在常规验证实验中，IP-MS 采用两种不同的抗体进行验证：目标抗体，以及至少一种专门靶向非相关靶标、表征良好的对照抗体。通过质谱法确定各个蛋白的丰度（例如，质谱信号强度），然后针对两种 IP 抗体绘图。蛋白分为三个不同的组别：
- 背景组—两种样本之中均存在的蛋白，出现在图的对角线中心区域。此类蛋白为通常结合到抗体或免疫沉淀所用的树脂中的背景蛋白。
- 阴性对照组—仅结合阴性对照抗体的蛋白，出现在 x 轴上（即，y 值为零）。此类蛋白为不与目标蛋白相互作用的阴性对照蛋白。
- 阳性组—仅结合目标抗体的蛋白，出现在 y 轴上（即，x 值为零）。此为目标抗体专门免疫沉淀的阳性蛋白。
显示了三种蛋白分组区别的 IP-MS 数据输出：背景组，阴性对照，以及仅含有目标抗体的阳性蛋白。
IP-MS 富集
确定阳性蛋白后，绘图比较免疫沉淀物相对于起始细胞裂解物的富集倍数。在阳性蛋白库中，还可发现并富集预期靶标之外的蛋白。这其中包括许多已知的，可在蛋白相互作用数据库中找到直接（红色）或间接（橙色）与目标蛋白（黑色）相互作用的蛋白。发现的未知是否与目标蛋白相互作用的蛋白（灰色），可能代表交叉反应性靶标或之前未鉴定出的相互作用蛋白。
采用抗-CDKN1A 抗体（货号 PA1-30399）免疫沉淀后，质谱分析蛋白相对富集情况。
IP-MS 抗体验证的局限
无法提供能将蛋白从裂解物沉淀出来的全部抗体。某一抗体可能无法识别未变性状态的目标蛋白。这不代表在其它应用中选择这种抗体就是不明智。但无法采用 IP-MS 法确认抗体的特异性。需要采用其他方法来确认这些抗体，包括转基因（敲除或敲低）、生物活化或其他方法。
采用 IP-MS 法验证 Invitrogen 抗体的靶标特异性
通过 IP-MS 法验证的 Invitrogen 抗体在搜索结果及相关产品页面上会显示“特异性通过验证”图标、在各个产品页面，提供了包含 IP-MS 富集数据的图表。
*“验证”或类似的表达仅指用于功能测试的研究用途抗体，旨在确认该抗体是否可用于指定研究技术。它 不能确保产品经过临床或诊断用途验证。