敲除细胞和敲低抗体验证*

采用转基因样本检测抗体性能

验证*抗体特异性是确保抗体不存在非特异性结合进而确保最高水平功能性的关键。转基因样本抗体性能检测，是确认抗体识别特定靶标的一种方法。此步骤可采用不同的方法完成，包括小鼠基因敲除模型，显性失活突变，吗啉代，siRNA 和最新的基因编辑技术。

Thermo Fisher Scientific 致力于提供市面上最佳的抗体产品。为确认 Invitrogen 抗体对特定靶标具有特异性，我们目前正在对整个产品系列进行重新检测。

通过 CRISPR-Cas9 系统，科研人员可以构建敲除细胞模型，从而将这些细胞模型作为验证抗体特异性的可靠对照。CRISPR-Cas9 系统采用非编码的单导向 RNA (sgRNA) 分子“引导”CRISPR 相关的 Cas9 核酸内切酶到达预定的目标基因，并在此切割 DNA。这一 DNA 切割的结果是目标基因被敲除。通过这一方法，CRISPR-Cas9 靶标可用来切除对应细胞模型的目标蛋白表达，进而使其成为确认抗体特异性的合适阴性对照。

CRISPR-Cas9 还可用来敲低上游介质的表达，从而通过单个通路同时检测抗体对多个信号传导蛋白的特异性。这种多重分析能力可用来实现简化、高通量的抗体验证。鉴于这一优势，CRISPR-Cas9 技术已成为首选的转基因抗体验证解决方案。

CRISPR-Cas9 敲除介导的抗体特异性验证原理

在下例中，分别单独和组合使用三种靶向单独靶向 Akt1 基因的 sgRNA，转染稳定表达 Cas9 内切酶的 U2OS 细胞 72小时。采用 Invitrogen AKT1 小鼠单克隆抗体（货号 AHO1112）进行免疫印迹 (WB) 和免疫荧光分析，结果发现蛋白表达明显下降，证明抗AKT1 抗体具有特异性。请注意，用于WB 的裂解液来自于混合细胞群而非单独的细胞克隆；因此，仍然存在较低水平的 AKT1。

通过 CRISPR 介导的敲低，AKT1 抗体在免疫印迹分析结果中表现出特异性。上样 15 µg U2OS-Cas9 细胞裂解物，进行 AKT1 免疫印迹分析。使用 AKT1 抗体（货号 AH01112），检测约 55 kDa 的 AKT1。使用GAPDH 上样对照进行数据标准化处理。sgRNA 1、2 和 3 的混合物中AKT1 蛋白表达减少，证明了抗体特异性。

sgRNA 2 与 sgRNA 1、2 和 3 的混合物导致蛋白表达显著下降。将稳定表达 Cas9 核酸酶的 U2OS 细胞铺盘到盖玻片上，在 24 小时后采用多个靶向 Akt1 基因（sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，或 sgRNA1、2、3 混合物）的 sgRNA 进行转染。转染后 72 小时，固定、透化，采用 AKT1 抗体（货号 AHO1112）进行探针标记。分别采用 Invitrogen SlowFade Gold 防淬灭封固剂（含 DAPI）及罗丹明鬼笔环肽染色细胞核和细胞骨架。使用 Nikon Ti-U 显微镜捕获 60 倍放大的图像。采用 sgRNA 2 与 sgRNA 1、2 和 3 混合物转染的细胞 AKT1 信号明显降低，印证了抗体特异性。

用于验证抗体特异性的 CRISPR-Cas9 实验。

RNA 干扰 (RNAi) 技术充分利用了细胞内在机制的优势来有效敲低目标基因的表达。这是一种广泛使用的抗体特异性验证方法。

在哺乳动物细胞中，双链 RNA 的短链部分又称短链干扰 RNA (siRNA)，可以启动特定的靶向细胞 mRNA 的消解或敲低。在这一过程中，siRNA 双链的反义链成为多蛋白复合物的一部分，也就是所谓的 RNA 诱导沉默复合物 (RISC)。RISC 随后识别互补的 mRNA 并在特定的目标位点将其切断。接下来，这一切除的信息靶向降解，最终导致蛋白表达缺失。

有多种不同的方法可进行 RNAi 实验。采用合成的小 RNA 库或通过 体外 切割（靶标 RNA 的 体外 切割）获得的 siRNA 库转染目标细胞，即可获得 RNAi。此外，还可采用短发卡 RNA (shRNA) 载体转染细胞获得 RNAi。在细胞内处理 shRNA ，之后即可采用 体外 生成的 siRNA 靶向其特异性降解 mRNA 分子。可采用非靶向对照检测敲低的特异性。

siRNA介导的靶向 mRNA 敲低原理。图示为在常规 RNAi 实验中使用体外合成的 siRNA。  

在下述实例中，首先降低 Invitrogen Silencer Select siRNAs 转染到 96 ，然后进行 RT-qPCR。通过基因表达分析，确定最有效的敲低（取决于细胞类型和 siRNA 转染条件）。随后扩大选定的筛选方案，通过免疫印迹和免疫组化 (ICC) 验证抗体特异性。

用于验证抗体特异性的敲低策略原理图

免疫印迹抗体验证。(A)采用靶向 SMAD2 的 siRNA 转染后，免疫印迹结果显示 HeLa 全细胞裂解物之中的 SMAD2 （图 3）敲低。此过程采用 Invitrogen SMAD2 ABfinity 兔单克隆抗体（货号 700048）。图 1 和图 2 分别为采用未处理和杂乱的 RNA 作为对照的敲低效果。采用肌动蛋白检测作为上样对照。(B)与作为阳性对照的未处理和杂乱 siRNA对比，SMAD2 免疫印迹条带敲低效果的相对定量。采用肌动蛋白条带的相对亮度，标准化各个条带亮度。

免疫组化抗体验证。(A)采用靶向 SMAD2 的 siRNA 转染后，免疫印迹结果显示 HeLa 全细胞裂解物之中的 RNF20 敲低。此过程采用 Invitrogen RNF20 ABfinity 兔单克隆抗体（货号 710911）。作为特异性对照的未处理和杂乱 RNA 以及作为上样对照的 GAPDH 表现出敲低。(B, C)Invitrogen™ Lipofectamine™ 对照和 siRNA 转染细胞的免疫组合图像表现出 RNF20 敲低。照片为 60 倍放大。
 

通过转基因样本对比验证的 Invitrogen 抗体在搜索结果及相关产品页面上会显示“特异性通过验证”图标、在各个产品页面将会提供证明验证内容的数据。

*“验证”或类似的表达仅指用于功能测试的研究用途抗体，旨在确认该抗体是否可用于指定研究技术。它 不能确保产品经过临床或诊断用途验证。