蛋白质在部分细胞或组织类型中表达，而在其他细胞或组织类型中则不表达。通过不同的应用（免疫荧光分析、免疫印迹、流式细胞术等）分析这些蛋白在不同的细胞或组织类型之中的相对表达情况，可确定抗体靶向特异性。例如，已知胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞 (iPS)和胚胎癌细胞系（例如，NCCIT 和 NTERA-2）之中存在并表达转录因子 Nanog。但许多其他细胞系（例如 HeLa 细胞）之中却不存在 Nanog。使用阳性和阴性细胞系时的 Nanog 抗体特异性如下所示。Nanog 的染色效果与预期的 Nanog 染色效果（右图，绿色）。Nanog 仅存在于 NTERA-2 细胞的细胞核内，在 HeLa 细胞中则不存在（左图）。

Endogenous Controls-Nanog

对 NTERA-2 和 HeLa 细胞之中的 Nanog (绿色)进行免疫荧光分析。采用含 0.1% Triton X-100 的 TBS，在室温下透化处理被福尔马林固定的细胞 10 分钟。在室温下，采用 1% BSA 封闭细胞 15 分钟。采用 1:50 稀释的 Nanog 单克隆抗体（货号 MA1-017）在室温下孵育细胞至少1 小时，采用 PBS 洗涤，然后和 DyLight 488 偶联的山羊抗小鼠 IgG 二抗（货号 35502）一起孵育。采用 DyLight 554 鬼笔环肽（货号 21834）染色 F-肌动蛋白（红色），采用 Hoechst 33342 染料（货号 62249）染色细胞核（蓝色）。图片为来自于 Thermo Scientific ToxInsight 成像型细胞仪的 20 倍放大图。

通过免疫印迹分析等其他方法，也可确认类似的信息。通过免疫印迹分析检测 Nanog 单克隆抗体（克隆 23D2-3C6）特异性时，采用的的全细胞裂解物为 2 种已知表达 Nanog 的细胞系：NCCIT 和 NTERA-2。采用 HeLa 全细胞裂解物作为阴性对照。如图所示，NCCIT 和 NTERA-2 细胞裂解物之中的 Nanog 可通过 ~38 kDA 处的主条带检测出，而 HeLa 细胞裂解物之中则检测不到 Nanog（左图）。此外，从 NCCIT 细胞获取细胞核和细胞质组分分离物，取等量各组分分离物蛋白分析 Nanog 的丰度。正如我们预计的那样，NCCIT 细胞的细胞核组分分离物检测到较高的 Nanog 丰度，进一步验证了预期蛋白定位和抗体介导检测之间的良好相关性。细胞质组分分离物之中仅检测到少量 Nanog，究其根源，很可能是因为各组分分离不完全所致（右图）。

Western blot

免疫印迹分析全细胞裂解物之中的 Nanog。将 60 µg 不同的全细胞裂解物和 10 µL PageRuler 预染蛋白分子量标准（货号 26616）上样到 4–20% 的 Tris-HCl 聚丙烯酰氨凝胶上，然后进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用 5% BSA/TBST 封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的 Nanog 单克隆抗体（货号 MA1-017）在 4°C 振荡平台上探针标记膜，在 TBS/0.1% Tween 20 之中洗涤，然后采用 1:20,000 稀释的山羊抗小鼠 IgG HRP 二抗（货号 31430）孵育至少 1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34078）进行化学发光检测。请注意，在阴性对照 HeLa 细胞裂解物之中不存在 Nanog。

Western blot

免疫印迹分析细胞核和细胞质组分分离物之中的 Nanog。将 60 µg NCCIT 细胞核和细胞质组分裂解物和 10 µL PageRuler 预染蛋白分子量标准（货号 26616）上样到 4–20% 的 Tris-HCl 聚丙烯酰氨凝胶上，然后进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用 5% BSA/TBST 封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的 Nanog 单克隆抗体（货号 MA1-017）在 4°C 振荡平台上探针标记膜，在 TBS/0.1% Tween 20 之中洗涤，然后采用 1:20,000 稀释的山羊抗小鼠 IgG HRP 二抗（货号 31430）孵育至少 1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34078）进行化学发光检测。使用 Thermo Scientific NE-PER 试剂盒（货号 78833）获取细胞核和细胞质组分分离物。

与此类似，已知 COS7 非洲绿猴肾脏成纤维细胞之中存在并表达转录因子 PAX8，而人 293T 细胞之中则不存在或表达这种转录因子。使用阳性和阴性细胞系时的 PAX8 抗体特异性如下所示。PAX8 的染色效果与预期的 PAX8 染色效果（右图，绿色）。PAX8 仅存在 COS7 细胞的细胞核之中，不存在于 293T 细胞中。

Immunofluorescence analysis of PAX8

免疫荧光分析 293T（左图）和 COS7 细胞（右图）之中的 PAX8（绿色）。采用含 0.1% Triton X-100 的 TBS，在室温下透化处理被福尔马林固定的细胞 10 分钟。在室温下，采用 1% BSA 封闭细胞 15 分钟。采用 PAX8 单克隆抗体（货号 MA1-117）在室温下孵育细胞至少 1 小时，采用 PBS 洗涤，然后和 1:400 稀释的 DyLight 488 偶联的山羊抗小鼠 IgG 二抗（货号 35502）一同在室温下孵育 30 分钟。采用 DyLight 554 鬼笔环肽（货号 21834）染色 F-肌动蛋白（红色），采用 Hoechst 33342 染料（货号 62249）染色细胞核（蓝色）。图片为来自于 Thermo Scientific ToxInsight 成像型细胞仪的 20 倍放大图。

为通过免疫印迹分析 PAX8 单克隆抗体（克隆 1F8-3A8）的特异性，采用了分别来自于 3 种阴性对照细胞和 4 种不同 PAX8 表达水平的阳性对照细胞系的全细胞裂解物。如图所示，ES2 卵巢透明细胞癌、MCF7 乳腺癌，Jurkat T 细胞白血病（左图）或 HeLa（右图）细胞系的全细胞裂解物均未检测到 PAX8。而在 Kuramochi 高级浆性卵巢癌、OVSAHO高级浆性卵巢癌、SKOV3 卵巢恶性腺瘤、FT246 永生化输卵管上皮（左图）和 COS7 细胞（右图）的全细胞裂解物之中，则在 ~50 kDa 处检测到了 PAX8 单克隆抗体（克隆 1F8-3A8）。所有结果与预期存在或不存在 PAX8 的情况相关性良好，证明 PAX8 单克隆抗体（克隆 1F8-3A8）在免疫印迹应用之中具有特异性。

Western blot analysis of PAX8

PAX8 免疫印迹分析。将 20 µg 指定全细胞裂解物上样到 Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris 聚丙酰胺凝胶上，进行电泳。将蛋白转印到硝酸纤维素膜上并采用含5% 牛奶的 PBST 封闭 1 小时。采用 1:500 稀释的 PAX8 单克隆抗体（货号 MA1-117）在 4°C 振荡平台上孵育膜，在 PBST 之中洗涤，然后采用山羊抗小鼠 IgG 二抗进行探针标记。同时，采用β-肌动蛋白抗体孵育样本，以实现等量蛋白上样对照。采用 ECL Plus 底物（货号 32132）进行化学发光检测。所用细胞裂解物来自于：ES2 卵巢透明细胞癌，MCF7 乳腺癌，Jurkat T 细胞白血病，Kuramochi 高级浆性卵巢癌，OVSAHO 高级浆性卵巢癌，SKOV3 卵巢恶性肿瘤，以及 FT246 永生化输卵管上皮细胞。

Western blot analysis of PAX8

PAX8 免疫印迹分析。将 60 µg SKOV-3、COS7 和阴性对照 HeLa 全细胞裂解物和 10 µL PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准（货号 26619）上样到 4–20% 的 Tris-HCl 聚丙烯酰氨凝胶上，进行电泳。将蛋白转印到 PVDF 膜上并采用 5% BSA/TBST 封闭至少 1 小时。采用 1:1,000 稀释的 PAX8 单克隆抗体（货号 MA1-117）在 4°C 振荡平台上孵育膜，在 TBS/0.1% Tween 20 之中洗涤，然后采用 1:500 预稀释的 HRP 偶联山羊抗小鼠 IgG 二抗（货号 32430）孵育1 小时。采用 SuperSignal West Pico 底物（货号 34080）进行化学发光检测。

流式细胞术从根本上促进了异质细胞群的相对表达模式分析。 使用门限技术，可通过分析不同细胞类型之中的表达情况，确认抗体结合能力。在如下实例中，采用流式细胞术研究全血中特定细胞群之中的已知标志物的染色情况。和我们根据已知的表达模式预测的情况一样，CD3 抗体仅染色淋巴细胞的一种亚型（T 细胞），HLA-DR 抗体可以染色单核细胞和淋巴细胞的一种亚型（B 细胞），CD16 抗体可以染色所有的粒细胞、单核细胞的一种亚型和淋巴细胞的一种亚型（NK 细胞）。

Normal human whole blood was surface stained with CD3, HLA-DR, and CD16
采用 CD3 （克隆 UCHT1，左侧）、HLA-DR （克隆 L243，中间）和 CD16（克隆 CB16，右侧）对正常的人全血进行表面染色。染色后，采用1步法固定/裂解液裂解红细胞。采用淋巴细胞（紫色柱状图）、单核细胞（橙色柱状图）或粒细胞（绿色柱状图）门限进行分析。

在第二个实例之中，正如我们根据已知表达模式预计的一样，Foxp3 抗体仅染色 CD4+ T 细胞的一个亚型，不会染色 CD8+ T 细胞。

Balb/c splenocytes were surface stained with CD3, CD4 and CD8

分别采用 CD3（克隆 17A2）、CD4（克隆 GK1.5）和 CD8（克隆 53-6.7）染色 Balb/c 脾细胞表面，然后采用 Foxp3/转录因子染色液系列依照实验方案进行 Foxp3（克隆 FJK-16s）胞内染色。采用 CD3+CD8+（蓝色柱状图）和 CD3+CD4+（紫色柱状图）之中的淋巴细胞进行分析。

*“验证”或类似的表达仅指用于功能测试的研究用途抗体，旨在确认该抗体是否可用于指定研究技术。它 不能确保产品经过临床或诊断用途验证。