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See how the enzyme was used in a SARS-CoV-2 research study by Xie X, Muruato A, Lokugamage KG, et al. (2020) An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe S1931-3128(20)30231-6.
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶错配率极低,可确保DNA 序列的高度准确性。经NGS检测,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的相对保真度 超过 Taq DNA 聚合酶的 300 倍。
图 1. 市面上商业供应PCR酶相对于 Taq 酶的保真度比较。 使用不同的 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增 3.9kb 的序列,然后用 MuA 转座酶将得到的 PCR 扩增子片段化。在片段化过程中引入了由 12 个随机核苷酸组成的独特分子标签(UMI),以单独标记每个产物。经NGS测序后,将reads与正确序列比对,按照UMI 分组,以此发现扩增中的错误。只有当错误出现在同一UMI标记的所有reads中时,错误才得以识别确认;否则将作为测序错误而被丢弃。以 Taq DNA 聚合酶作为标准来衡量聚合酶的保真度。
了解高保真PCR及其应用。了解如何使用高保真 PCR 酶减少扩增错误。
Platinum SuperFi II 缓冲液的独特配方有助于减少 PCR 中繁琐的优化步骤。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶时,不再需要计算退火步骤的引物解链温度。按照一般的引物设计规则(图 2)得到的引物,无论引物序列如何,该创新的缓冲液均能够实现使用60°C的统一引物退火温度。当然如果在退火步骤中使用自己计算的 Tm 时,该缓冲液同样能确保成功进行扩增(数据未显示)。
图2.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶在 60°C 的通用退火温度下可获得具有高特异性和高产率的 PCR 产物。使用不同退火温度的引物对在 60°C 退火温度下从 50ng 人基因组 DNA中扩增 12 个靶标。所使用的分子量标准为是 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。以上用于 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度是经使用 Tm 计算器计算得到的。
由于使用创新型的反应缓冲液,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可使用通用的退火温度和灵活的延长时间,实现多个PCR反应的同时扩增。
图 3.借助通用 PCR 扩增方案节约时间和实现不同PCR反应的同时扩增。使用一般的PCR 试剂,扩增每个 DNA 片段都需要特定的扩增方案,这是由于需要不同的引物退火温度和延伸步骤;因此,在同一次 PCR 运行中通常不能将多个靶标一起进行扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶,可以使用一种通用扩增方案将不同的 PCR反应同时进行扩增,该扩增方案使用60°C通用引物退火温度和按最长片段计算的延伸时间(图 4)。
图 4.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可以实现短片段和长片段的同时扩增。从 100 ng 人类基因组 DNA 中扩增 0.7 kb、2.0 kb、4.8 kb 和 14 kb 片段,均使用相同的扩增方案:98℃ 变性 10 秒,60℃ 退火 10 秒,72℃ 延伸 7 分钟。 延伸时间基于最长片段进行计算。
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix 可实现 PCR 产物直接上样电泳,省去了 PCR 样品中加染料的环节,且有助于减少移液错误。绿色缓冲液与下游实验应用相兼容,包括DNA 测序、连接和限制性酶切和连接。
图 5.绿色预混液可实现 PCR 产物直接加样至凝胶中进行分析。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的预混液可提供含绿色缓冲液的形式,其中包含一种密度试剂和两种示踪染料。借助两种染料(蓝色和黄色),可以在电泳过程中轻松地观察 DNA 条带的迁移(如右图电泳5 分钟和 15 分钟的泳道)。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶错配率极低,可确保DNA 序列的高度准确性。经NGS检测,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的相对保真度 超过 Taq DNA 聚合酶的 300 倍。
图 1. 市面上商业供应PCR酶相对于 Taq 酶的保真度比较。 使用不同的 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增 3.9kb 的序列,然后用 MuA 转座酶将得到的 PCR 扩增子片段化。在片段化过程中引入了由 12 个随机核苷酸组成的独特分子标签(UMI),以单独标记每个产物。经NGS测序后,将reads与正确序列比对,按照UMI 分组,以此发现扩增中的错误。只有当错误出现在同一UMI标记的所有reads中时,错误才得以识别确认;否则将作为测序错误而被丢弃。以 Taq DNA 聚合酶作为标准来衡量聚合酶的保真度。
了解高保真PCR及其应用。了解如何使用高保真 PCR 酶减少扩增错误。
Platinum SuperFi II 缓冲液的独特配方有助于减少 PCR 中繁琐的优化步骤。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶时,不再需要计算退火步骤的引物解链温度。按照一般的引物设计规则(图 2)得到的引物,无论引物序列如何,该创新的缓冲液均能够实现使用60°C的统一引物退火温度。当然如果在退火步骤中使用自己计算的 Tm 时,该缓冲液同样能确保成功进行扩增(数据未显示)。
图2.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶在 60°C 的通用退火温度下可获得具有高特异性和高产率的 PCR 产物。使用不同退火温度的引物对在 60°C 退火温度下从 50ng 人基因组 DNA中扩增 12 个靶标。所使用的分子量标准为是 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。以上用于 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度是经使用 Tm 计算器计算得到的。
由于使用创新型的反应缓冲液,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可使用通用的退火温度和灵活的延长时间,实现多个PCR反应的同时扩增。
图 3.借助通用 PCR 扩增方案节约时间和实现不同PCR反应的同时扩增。使用一般的PCR 试剂,扩增每个 DNA 片段都需要特定的扩增方案,这是由于需要不同的引物退火温度和延伸步骤;因此,在同一次 PCR 运行中通常不能将多个靶标一起进行扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶,可以使用一种通用扩增方案将不同的 PCR反应同时进行扩增,该扩增方案使用60°C通用引物退火温度和按最长片段计算的延伸时间(图 4)。
图 4.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可以实现短片段和长片段的同时扩增。从 100 ng 人类基因组 DNA 中扩增 0.7 kb、2.0 kb、4.8 kb 和 14 kb 片段,均使用相同的扩增方案:98℃ 变性 10 秒,60℃ 退火 10 秒,72℃ 延伸 7 分钟。 延伸时间基于最长片段进行计算。
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix 可实现 PCR 产物直接上样电泳,省去了 PCR 样品中加染料的环节,且有助于减少移液错误。绿色缓冲液与下游实验应用相兼容,包括DNA 测序、连接和限制性酶切和连接。
图 5.绿色预混液可实现 PCR 产物直接加样至凝胶中进行分析。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的预混液可提供含绿色缓冲液的形式,其中包含一种密度试剂和两种示踪染料。借助两种染料(蓝色和黄色),可以在电泳过程中轻松地观察 DNA 条带的迁移(如右图电泳5 分钟和 15 分钟的泳道)。
由于酶的强劲扩增能力和出色的热启动技术,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可高产量地、高特异性地扩增多种不同长度的片段。基于抗体的 Platinum 热启动技术在最初的 PCR 变性步骤之前抑制酶的活性,防止非特异性扩增和引物降解,同时可确保目的片段的高产量扩增。
图 6.适用于扩增多种不同长度的片段Platinum SuperFi II DNA 聚合酶(左侧泳道)可高产量和高特异性地从 100 ng 人类基因组 DNA 扩增 0.3 kb 至 14 kb 的DNA 片段。同时使用其他 DNA 聚合酶扩增相同的靶标。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的高灵敏度可以实现低丰度 DNA 模板的检测,并获得准确的扩增结果。在起始材料有限或样品中目标 DNA 浓度较低的实验中,DNA聚合酶的高灵敏度是非常有利的。
图 7.从少量起始 DNA 中实现高灵敏度和可靠的扩增。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶(左侧泳道)可分别从 0.4 ng、2 ng、10 ng、50 ng 和 250 ng 人基因组 DNA中稳定扩增一个 2 kb 的片段(模板量显示在每个泳道上方)。同时使用其它DNA 聚合酶扩增相同的靶标。预估的拷贝数约为每 0.4ng 人类基因组 DNA 中100 个拷贝。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶经设计含有 DNA 结合结构域,从而实现高持续合成能力,并增强对常见 PCR 抑制剂的耐受性,如氯化血红素(红细胞成分)、木聚糖(植物生物聚合物)和腐殖酸(土壤)。
图 8.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶显示出对常见 PCR 抑制剂的高度耐受性。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶和其他高保真 DNA 聚合酶从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 2 kb 人类基因组 DNA 片段。反应混合物中包含 1—无抑制剂,2—腐植酸(4 µg/mL),3—血红素(20 µM),或者 4—胆盐(1 mg/mL)。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的室温稳定性得到增强,可实现高通量PCR扩增。其卓越的 Platinum 热启动技术可实现室温稳定性和酶的高特异性。
图 9.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶配制的反应体系可在室温下保持稳定。从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出一个 0.5 kb 的片段。配制 PCR 反应体系,并在室温下放置 0 小时和 24 小时,然后再通过Applied Biosystems ProFlex 热循环仪进行扩增。可以看到,即使在室温下放置 24 小时后,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶(泳道 P)也能获得高特异性和高产量的扩增结果。同时使用其它 DNA 聚合酶进行同样的实验。所使用的分子量标准是 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶由于其酶的强扩增能力和使用特殊的缓冲液,可以高特异性地扩增各种序列。Platinum SuperFi II 缓冲液可扩增高 GC 含量的靶标,而无需添加 DNA 解链添加剂。
图 10.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶强劲扩增富含 AT 和 GC 的靶标。从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 15 个具有不同 GC 含量的靶标,而未添加任何有助于 DNA 变性的添加剂。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 11.强劲扩增富含 GC 的靶标。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可对高GC含量靶标进行高特异性和高产量的扩增(左侧泳道),而未添加任何 DNA 解链添加剂。从 50 ng 人基因组 DNA 中扩增出四个富含 GC 的片段(长度分别为 0.74 kb、0.58 kb、0.71 kb 和 0.72 kb;GC 含量如上标注)。根据制造商推荐的用于高 GC 含量模板的 PCR 扩增方案,使用同类DNA 聚合酶同时扩增相同的靶标。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
由于其高持续合成能力和极低的错配率,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶是准确扩增长片段(长达 20 kb)的理想选择,其还可扩增更长的靶标(长达 40 kb),但可能需要进行一些优化,例如使用高质量的模板(纯净、新鲜和完整的模板)和新鲜的引物溶液。将引物浓度降低至 0.2 μM 也可以改善PCR扩增结果。
图 12.长片段扩增。使用Platinum SuperFi II DNA 聚合酶(泳道 P)成功地从 200 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 20 kb 的靶标。使用相同的引物对,同类DNA 聚合酶也进行了测试。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 13.扩增 >20 kb片段。使用Platinum SuperFi II DNA 聚合酶(泳道P)从 50 ng 的大肠杆菌基因组 DNA 中成功扩增出 30 kb 的靶标和 40 kb 的靶标。使用相同的引物对,同类DNA 聚合酶也进行了测试。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 14.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶对不同浓度模板进行多重 PCR扩增。从 2.5 ng、25 ng 和 250 ng 人类基因组 DNA 中(模板量显示在每个泳道上方)同时扩增15 个靶标(99 bp;131 bp;160 bp;199 bp;251 bp;300 bp;345 bp;400 bp;516 bp;613 bp;735 bp;908 bp;1,005 bp;1,190 bp;和 1,606 bp)。所使用的分子量标记为 TrackIt 100 bp DNA Ladder。
由于具有高特异性和高抑制剂耐受性,Platinum SuperFi II DNA 聚合酶能够高效扩增质量不佳的 DNA 模板,如福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本。
图 15.对FFPE 样本 DNA 的扩增。对于使用Invitrogen RecoverAll FFPE 总核酸分离试剂盒提取的 10 ng 小鼠 FFPE DNA, Platinum SuperFi II DNA聚合酶可从中成功扩增长达 0.4 kb 的片段。所使用分子量标记为 TrackIt 100 bp DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的缓冲液中含有共稳定组分。这种独特的缓冲液成分带来了多种优势:不需要 Tm 计算引物的Tm,对富含 GC 靶标的扩增能力更强,可扩增更长的片段,以及可使用通用 PCR 扩增方案更适合高通量 PCR扩增(表 1)。
表 1.Platinum SuperFi II 和 Platinum SuperFi DNA 聚合酶之间的比较。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶 | Platinum SuperFi DNA 聚合酶 | |
---|---|---|
保真度(vs. Taq) | 超出 300 倍 | 超出 300 倍 |
热启动修饰 | 是 | 是 |
需要Tm 计算器 | 否(60°C 下引物退火) | 是 |
通用 PCR 扩增方案 | 是 | 否 |
高 GC 含量模板扩增 | 是(无需 GC enhancer) | 是(推荐 GC enhancer) |
长片段扩增 | 长达 20 kb(性能得到增强) | 长达 20 kb |
室温稳定性 | 长达 24 小时 | 长达 24 小时 |
抑制剂耐受性 | 高 | 高 |
扩增子的 3‘ 端 | 平末端 | 平末端 |
残留 DNA(每 50 μL rxn) | ≤1 个细菌 DNA 拷贝 ≤ 0.3 个人类 DNA 拷贝 | ≤1 个细菌 DNA 拷贝 ≤ 0.2 个人类 DNA 拷贝 |
Usage | Reference |
---|---|
Multiplex PCR for detection of S. aureus genes | Allam A, Fakhr A, Mahmoud M et al. (2021) Staphylococcus aureus nasal colonization among health care workers at an Egyptian tertiary care hospital. Microbes and Infectious Diseases 2(1):108–118. |
PCR with gDNA and cDNA of fungal samples, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Gallo A, Perrone G et al. (2020) Comparative genomic analysis of ochratoxin A biosynthetic cluster in producing fungi: new evidence of a cyclase gene involvement. Front Microbiol 11:581309. |
Usage | Reference |
---|---|
Amplification of bacterial full-length genes, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Haidukowski M, D'Imperio M et al. (2021) New insight into microbial degradation of mycotoxins during anaerobic digestion. Waste Manag 119:215–225. |
Metabarcording of fish DNA from pumped deep-sea water | Kawato M, Yoshida T, Miya M et al. (2021) Optimization of environmental DNA extraction and amplification methods for metabarcoding of deep-sea fish. MethodsX 8: 101238. |
Usage | Reference |
---|---|
Cloning of VH and VL regions of an immunoglobulin | Granel J, Lemoine R, Morello E (2020) 4C3 human monoclonal antibody: a proof of concept for non-pathogenic proteinase 3 anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in granulomatosis with polyangiitis. Front Immunol 11:573040. |
RT-PCR with human liver and testis samples for microRNA expression analysis, followed by Sanger sequencing | Rubino E, Cruciani M, Tchitchek N (2021) Human ubiquitin-specific peptidase 18 is regulated by microRNAs via the 3'untranslated region, a sequence duplicated in long intergenic non-coding RNA genes residing in chr22q11.21. Front Genet 11:627007. |
Usage | Reference |
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Multiplex PCR for detection of S. aureus genes | Allam A, Fakhr A, Mahmoud M et al. (2021) Staphylococcus aureus nasal colonization among health care workers at an Egyptian tertiary care hospital. Microbes and Infectious Diseases 2(1):108–118. |
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Usage | Reference |
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