通过去除小鼠脾脏或淋巴结细胞中的非 CD4+ T 细胞(CD8+ T 细胞、B 细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK 细胞、树突状细胞、红细胞和粒细胞)来分离未接触的小鼠 CD4+ T 细胞。其他来源的小鼠 CD4+ T 细胞在针对特定应用进行优化后也可用作起始材料。分离的 CD4+ T 细胞无微珠和抗体,适用于任何下游应用
分离原理
向起始样本中加入抗非 CD4+ T 细胞的单克隆抗体混合物。加入小鼠 Depletion Dynabeads,让其在短暂的孵育过程中结合非 CD4+ T 细胞。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触小鼠 CD4+ T 细胞用于任何应用
材料描述
Dynabeads 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠(直径 4.5 μm),包被了多克隆绵羊抗大鼠 IgG 抗体。
Dynal 小鼠 CD4 阴性分离试剂盒
货号 | 114.15D | 114.16D* |
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处理的细胞数 | 高达 1 × 109 | 高达 2 × 108 |
小鼠 Depletion Dynabeads | 2 × 10 mL | 4 mL |
抗体混合物 | 2 mL | 0.4 mL |
* 入门试剂盒
- 小鼠 Depletion Dynabeads - 以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度为 4 x 108 个微珠/mL。
- 抗体混合物 - 抗体混合物含有抗小鼠 CD45R (B220)、CD11b (MAC-1)、Ter-119、CD16/32 和 CD8 的大鼠单克隆抗体的混合物。以含有 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的 PBS 的形式提供。
所需的其他材料
- 磁铁
- 热灭活胎牛血清 (FCS)。
- 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
- 缓冲液1:含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS(不含 Ca2+ 和 Mg2+),pH 7.4。
重要提示:
- BSA 可用 FCS 代替。
- EDTA 可用柠檬酸钠代替。
- 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。
- 本产品不可与磁铁 MPC-1 配合使用。
- 让缓冲液保持低温!
Dynabeads 洗涤程序
使用前,应先洗涤 Dynabeads。
1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。
2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。
3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。
4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
5. 从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。
样本制备
请参阅从小鼠脾脏或淋巴结制备细胞的推荐程序。
细胞分离的关键步骤
- 使用可以倾斜和旋转试管的混合器,确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
- 对于每 1 x 107 个白细胞,切勿使用少于 200 μL 的 Dynabeads
- 为确保成功分离,请务必遵循磁铁建议。
从脾脏或淋巴结白细胞中分离小鼠 CD4+ T 细胞
此方案基于 1 x 107 个白细胞。细胞数量可以从 1 x 107 增加到 1 x 109(见表1)。
- 将缓冲液1中的 100 μL (1 x 107) 白细胞转移到试管中。
- 加入 20 μL 热灭活 FCS。
- 加入 20 μL 抗体混合物。
- 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。
- 加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀,并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。
- 在 800 μL 缓冲液1中重悬细胞。
- 加入 200 μL 经过预洗涤的小鼠 Depletion Dynabeads。
- 在 18-25°C 下孵育15分钟,同时轻轻倾斜和旋转试管。
- 使用窄口移液器(如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器)轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。
- 加入 1 mL 缓冲液1。
- 将试管放入磁铁2分钟。
- 将上清液转移到新试管中。
上清液含有阴性分离的小鼠 CD4+ T 细胞。
表1. 分离小鼠 T 细胞时每 1 x 107 个起始白细胞所需的体积。
| 每 1 x 107 个白细胞的工作体积 |
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细胞体积(第1步) | 100 μL |
FCS(第2步) | 20 μL |
抗体混合物(第3步) | 20 μL |
洗涤(第5步) | 2 mL |
重悬(第6步) | 800 μL |
小鼠 Depletion Dynabeads(第7步) | 200 μL |
放入磁铁前加入的体积(第10步) | 1 mL |
推荐的 DynaMag™ | DynaMag-15/ DynaMag-50 |
处理更多细胞时,请相应增加所有试剂和体积(例如,对于 2 x 107 个白细胞,使用所有指定试剂体积的两倍体积)。根据经验,在一支 15 mL 试管中可处理多达 5 x 107 个白细胞,在一支 50 mL 试管中可处理多达 2 x 108 个白细胞。
下游应用
分离的小鼠 CD4+ T 细胞可用于细胞培养、流式细胞分析、功能性试验和分子研究等应用。
Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。
材料描述
Dynabeads FlowComp™ 是均匀的超顺磁性微珠(直径 2.8 μm)。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN
3)(作为防腐剂)的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度约为 1 × 10
9 个微珠 (10 mg)/mL。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下,在标签上注明的失效日期前,本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中,始终让 Dynabeads 处于悬浮液中,因为干燥会导致性能降低。使用前,请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明,否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠(作为防腐剂,具有细胞毒性)。
不要用嘴吹打!
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应,形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时,请用大量水冲洗,以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在
获得。
- Comer JE et al (2005).Direct Inhibition of T-Lymphocyte Activation by Anthrax Toxins In Vivo.Infection and Immunity, vol 73 (12), pp. 8275-8281.
- Toscano MA et al (2007).Differential glycosylation of TH1, TH2 and TH-17 effector cells selectively regulates susceptibility to cell death.Nature Immunology, vol 8 (8), pp.825-834.
114.15D_16D.indd 版本004 2009年5月5日