Dynabeads FlowComp 小鼠 CD8—与流式细胞术兼容且基于试管的小鼠 CD8+ T 细胞分离

本产品适用于阳性磁性分离淋巴器官中的 CD8⁺ T 细胞。提供的方案描述了从 5x10⁷ 个细胞中磁性标记和分离细胞的步骤。第一步，FlowComp™ 小鼠 CD8 抗体（抗小鼠 CD8 的大鼠 IgG2a 抗体）与靶细胞结合。第二步，使用 Dynabeads 捕获已结合特异性抗体的 CD8⁺ T 细胞。最后一步，从细胞中去除微珠。

下游应用

分离的细胞可直接用于任何下游应用，如流式细胞分析。请参阅推荐产品和方案。

其他要求

• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，货号 14190-094（有关更多信息，请参阅技术支持）。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 磁铁（DynaMag 或 Dynal MPC）
• 推荐的流式细胞分析抗体试剂 CD3-Alexa Fluor 488（货号 HM3420）；CD8a-PE（货号 MCD0804）。
• 关于活力评估，推荐产品为 SYTOX Red（货号 S34859）。

重要提示

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
• 本产品不可与磁铁 Dynal MPC-1 配合使用。
• 切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads。
• 请小心遵循推荐的移液体积和孵育时间。
• 移液时，避免出现气泡。
• 如要在分离后进行流式细胞染色，建议使用 Caltag 克隆体 5H10 作为荧光一抗。避免使用对大鼠抗体具有特异性的二抗进行流式细胞分析染色。
• 请勿将本试剂盒与您自己的生物素化抗体结合使用。

大约 30-35% 的小鼠脾细胞为 T 细胞，其中约有 30% 的 T 细胞会强烈表达 CD8 抗原。本试剂盒可分离高纯度 CD8⁺ T 细胞。本方案描述了使用 Dynabeads FlowComp 小鼠 CD8 从 5x10⁷ 个小鼠淋巴细胞中磁性标记和分离 CD8⁺ T 细胞的步骤。 

制备

• 从淋巴器官（如淋巴结或脾脏）制备单细胞悬液。
• 每 5x10⁷ 个细胞制备约 10 mL 分离缓冲液。

分离程序

当处理的细胞少于 5x10⁷ 个时，请使用以下所示的体积。处理更多细胞时，请相应增加所有试剂体积和总体积。

• 在 500 μL 分离缓冲液中重悬 5x10⁷ 个细胞并加入 25 μL FlowComp 小鼠 CD8 抗体。
• 混合均匀并在 2-8°C 下孵育10分钟。*** 
• 加入 2 mL 低温分离缓冲液来洗涤细胞，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。
• 去除并丢弃上清液。
• 向细胞团块中加入 1 mL 低温分离缓冲液并重悬。
• 加入 75 μL 重悬后的 FlowComp Dynabeads 并混合均匀。
  
• 在 2-8°C 下，以滚动、倾斜的方式孵育15分钟。***  
• 将试管放入磁铁至少1分钟。小心去除并丢弃上清液。
• 从磁铁中取出试管。加入至少 1 mL 低温分离缓冲液，并通过轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。
• 将试管放入磁铁至少1分钟。小心去除并丢弃上清液。
• 从磁铁中取出试管并在 1 mL FlowComp 释放缓冲液中小心地重悬微珠结合细胞。
• 在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育10分钟。***  
• 轻轻吹打5次以混匀细胞，然后将试管放入磁铁1分钟。
• 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中，再将该试管放入磁铁1分钟以去除残留的所有微珠。
• 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中。
• 加入 2 mL 分离缓冲液，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。
• 丢弃上清液并在首选细胞培养基中重悬细胞团块。在 2-8°C 下保存细胞，直至进一步用于下游应用。

***孵育时间

更多技术建议。如要在分离后进行流式细胞染色，建议使用 Caltag 克隆体 5H10 作为荧光一抗。

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