介绍

通过去除小鼠脾脏或淋巴结细胞中的非 T 细胞(B 细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK 细胞、树突状细胞、红细胞和粒细胞)来分离未接触的小鼠 T 细胞。其他来源的小鼠 T 细胞在针对特定应用进行优化后也可用作起始材料。分离的 T 细胞无微珠和抗体,适用于任何下游应用。

分离原理

向起始样本中加入抗非 T 细胞的单克隆抗体混合物。加入小鼠 Depletion Dynabeads,让其在短暂的孵育过程中结合非 T 细胞。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触小鼠 T 细胞用于任何应用

材料描述

Dynabeads 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠(直径 4.5 μm),包被了多克隆绵羊抗大鼠 IgG 抗体。

提供的材料

Dynal 小鼠 T 细胞阴性分离试剂盒含有小鼠 Depletion Dynabeads 和抗体混合物。

  • 2 x 10 mL 小鼠 Depletion Dynabeads。

以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度为 4 x 10 8 个微珠/mL。

  • 2 mL 抗体混合物。

抗体混合物含有抗小鼠 CD45R (B220)、CD11b (Mac1)、
Ter-119 和 CD16/32 的大鼠单克隆抗体的混合物。以含有 0.02% 叠氮化钠 (NaN 3) 的 PBS 的形式提供。

  • 本试剂盒将处理多达 1 x 109 个白细胞。

所需的其他材料

  • 磁铁:(Dynal MPC™) - MPC-L 适用于 1-5 mL 样本,MPC-15 适用于 1-15 mL 样本,MPC-50 适用于 15-50 mL 样本。
  • 热灭活胎牛血清
  • (FCS)。
  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • 缓冲液1:含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS(不含 Ca2+ 和 Mg2+),pH 7.4。
  • 缓冲液2:含 10% FCS 的 RPMI-1640。

让缓冲液保持低温!

重要提示:

BSA 可用 FCS 代替。

EDTA 可用柠檬酸钠代替。

不建议使用含 Ca 2+ 或 Mg 2+ 的 PBS。

方案

Dynabeads 洗涤程序

使用前,应先洗涤 Dynabeads。

  1.   在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2.   将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3.   加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。

  4.   将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5.   从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备

有关从小鼠脾脏或淋巴结制备细胞的推荐程序,请访问 /samplepreparation

细胞分离的关键步骤

  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器,确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
  • 对于每 1 x 107 个样本 MNC,切勿使用少于 200 μL 的 Dynabeads。
  • 为确保成功分离,请务必遵循磁铁建议。


从脾脏或淋巴结白细胞中分离小鼠 T 细胞

此方案基于 1 x 107 个白细胞。细胞数量可以从 1 x 107 增加到 1 x 109(见表1)。

  1. 将缓冲液1中的 100 μL (1 x 107) 白细胞转移到试管中。

  2. 加入 20 μL 热灭活 FCS。

  3. 加入 20 μL 抗体混合物。

  4. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。

  5. 加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀,并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。

  6. 在 800 μL 缓冲液1中重悬细胞。

  7. 加入 200 μL 经过预洗涤的小鼠 Depletion Dynabeads。

  8. 在 18-25°C 下孵育15分钟,同时轻轻倾斜和旋转试管。

  9. 使用窄口移液器(如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器)轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。

  10. 加入 1 mL 缓冲液1。

  11. 将试管放入磁铁2分钟。

  12. 将上清液转移到新试管中。


上清液含有阴性分离的小鼠 T 细胞。

表1. 分离小鼠 T 细胞时每 1 x 107 个起始白细胞所需的体积。

每 1 x 107 个白细胞的工作体积
细胞体积(第1步)100 μL
FCS(第2步)20 μL
抗体混合物(第3步)20 μL
洗涤(第5步)2 mL
重悬(第6步)800 μL
小鼠 Depletion Dynabeads(第7步)200 μL
放入磁铁前加入的体积(第10步)1 mL
推荐的 Dynal MPCMPC-L/MPC-15/MPC-50



处理更多细胞时,请相应增加所有试剂和体积(例如,对于 2 x 107 个白细胞,使用所有指定试剂体积的两倍体积)。根据经验,在一支 15 mL 试管中可处理多达 5 x 107 个白细胞,在一支 50 mL 试管中可处理多达 2 x 108 个白细胞。

下游应用

分离的小鼠 T 细胞可用于细胞培养、流式细胞分析、功能性试验和分子研究等应用。

基本信息

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

材料描述

Dynabeads FlowComp™ 是均匀的超顺磁性微珠(直径 2.8 μm)。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN 3)(作为防腐剂)的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度约为 1 × 10 9 个微珠 (10 mg)/mL。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下,在标签上注明的失效日期前,本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中,始终让 Dynabeads 处于悬浮液中,因为干燥会导致性能降低。使用前,请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明,否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠(作为防腐剂,具有细胞毒性)。

不要用嘴吹打!

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应,形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时,请用大量水冲洗,以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。
114.13D.indd    版本003      2006年5月5日

仅供科研使用,不可用于诊断目的。