小鼠 CD4 (L3T4)

直接分离或去除脾脏或淋巴结细胞悬液中的小鼠 CD4+ T 细胞。Dynabeads 可用 DETACHaBEAD（未提供，单独出售，货号 124.06D）进行分离。分离的细胞不含微珠和抗体，表型未发生改变，适合任何下游应用，包括流式细胞分析、功能研究和扩增。

分离原理

Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离微珠结合细胞。

• 去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。
• 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用（如分子分析或细胞培养）。
• 分离（可选）– 使用 DETACHaBEAD 小鼠 CD4（货号 124.06D）轻轻释放阳性分离细胞。

材料描述

Dynabeads 小鼠 CD4 (L3T4) 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了大鼠单克隆抗体。该抗体对所有常见小鼠品系的胸腺细胞和成熟 T 细胞的辅助性 T 细胞亚群上表达的 L3T4 膜抗原具有特异性。

提供的材料

• 5 mL Dynabeads 小鼠 CD4 (L3T4) - 以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个 Dynabeads/mL。
• 本产品将处理多达 2 x 10⁹ 个白细胞

所需的其他材料

• DynaMag™ 磁铁：有关磁铁建议，请访问 www.lifetechnologies.com/magnets。
• 推荐的培养基：RPMI 1640 或含 10% FCS 的 DMEM，在 CO₂ 环境中培养。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号 14190-094）。
• DETACHaBEAD 小鼠 CD4 – 货号 124.06（可选，用于在阳性分离后释放微珠上的细胞）。
  

重要提示：

• 让缓冲液保持低温。
• BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
• EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。

重要提示：

• 使用前，应先洗涤 Dynabeads（请参阅“Dynabeads 洗涤程序”）
• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
• 本产品不可与 Dynal MPC™-1（货号 120.01D）配合使用。
• 请遵循推荐的体积和孵育时间。
• 对于每 mL 细胞样本，切勿使用少于 25 μL 的 Dynabeads。
• 移液时，避免出现气泡。
• 孵育 Dynabeads 和细胞时，请将温度保持在 2-8°C，以尽量减少吞噬活性和其他代谢过程。

Dynabeads 洗涤程序

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。


4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads。

制备

小鼠细胞通常从脾脏、胸腺或淋巴结中获得，但也可使用其他来源。以 1 x 10⁷ 个细胞/mL 分离缓冲液的浓度重悬细胞。

分离程序

下面介绍的方案描述了去除和/或阳性分离小鼠 CD4+ T 细胞的步骤。

表1：每 1 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

此方案基于 1 x 10⁷ 个细胞。当处理的细胞少于 1 x 10⁷ 个时，请使用以下所示的体积。处理更多细胞时，请相应增加所有试剂和总体积。

1. 如需阳性分离，向制备的细胞样本中加入 25 μL Dynabeads（如需去除，则使用 50 μL Dynabeads）。


2. 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。


3. 将试管放入磁铁2分钟。


4. 如需去除，将上清液转移至新试管中，待进一步使用。


5. 如需阳性分离，丢弃上清液并洗涤微珠结合细胞3次（洗涤方法：在 1 mL 分离缓冲液中重悬），然后使用磁铁进行分离。

关于从阳性分离细胞释放 Dynabeads 的方案，请参阅 DETACHaBEAD 小鼠 CD4 包装说明书（货号 124.06D）。对于分子研究，在细胞仍附着到微珠时进行裂解，并将上清液转移至新试管中以用于进一步 mRNA、蛋白或其他亚细胞分离。有关其他推荐的样本制备程序，请访问 /cellisolation。