通过去除非 CD8+ T 细胞来分离未接触的小鼠 CD8+ T 细胞

通过去除小鼠脾脏或淋巴结细胞中的非 CD8⁺ T 细胞（CD4⁺ T 细胞、B 细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK 细胞、树突状细胞、红细胞和粒细胞）来分离未接触的小鼠 CD8⁺ T 细胞。其他来源的小鼠 CD8⁺ T 细胞在针对特定应用进行优化后也可用作起始材料。分离的 CD8⁺ T 细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用

分离原理

向起始样本中加入抗非 CD8⁺ T 细胞的单克隆抗体混合物。加入小鼠 Depletion Dynabeads，让其在短暂的孵育过程中结合非 CD8⁺ T 细胞。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触小鼠 CD8⁺ T 细胞用于任何应用

材料描述

Dynabeads 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了多克隆绵羊抗大鼠 IgG 抗体。

• 2 x 10 mL 小鼠 Depletion Dynabeads。 以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个微珠/mL。
  

• 2 mL 抗体混合物。 抗体混合物含有抗小鼠 CD45R (B220)、CD11b (Mac1)、Ter-119、CD16/32 和 CD4 的大鼠单克隆抗体的混合物。以含有 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的 PBS 的形式提供。
  

• 本试剂盒将处理多达 1 x 10⁹ 个白细胞

所需的其他材料

• 磁铁
• 热灭活胎牛血清 (FCS)。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺），pH 7.4。

重要提示：

• BSA 可用 FCS 代替。
• EDTA 可用柠檬酸钠代替。
• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。
• 让缓冲液保持低温！

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

  1.   在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2.   将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3.   加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。

  4.   将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5.   从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备

请参阅从小鼠脾脏或淋巴结制备细胞的推荐程序。


细胞分离的关键步骤

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
• 对于每 1 x 10⁷ 个白细胞，切勿使用少于 200 μL 的 Dynabeads
• 为确保成功分离，请务必遵循磁铁建议。

从脾脏或淋巴结白细胞中分离小鼠 CD8⁺ T 细胞

此方案基于 1 x 10⁷ 个白细胞。细胞数量可以从 1 x 10⁷ 增加到 1 x 10⁹（见表1）。

1. 将缓冲液1中的 100 μL (1 x 10⁷) 白细胞转移到试管中。


2. 加入 20 μL 热灭活 FCS。


3. 加入 20 μL 抗体混合物。


4. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。


5. 加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。


6. 在 800 μL 缓冲液1中重悬细胞。


7. 加入 200 μL 经过预洗涤的小鼠 Depletion Dynabeads。


8. 在 18-25°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


9. 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。


10. 加入 1 mL 缓冲液1。


11. 将试管放入磁铁2分钟。


12. 将上清液转移到新试管中。

上清液含有阴性分离的小鼠 CD8⁺ T 细胞。

表1. 分离小鼠 CD8⁺ T 细胞时每 1 x 10⁷ 个起始白细胞所需的体积。

处理更多细胞时，请相应增加所有试剂和体积（例如，对于 2 x 10⁷ 个白细胞，使用所有指定试剂体积的两倍体积）。根据经验，在一支 15 mL 试管中可处理多达 5 x 10⁷ 个白细胞，在一支 50 mL 试管中可处理多达 2 x 10⁸ 个白细胞。

下游应用

分离的小鼠 CD8⁺ T 细胞可用于细胞培养、流式细胞分析、功能性试验和分子研究等应用。