HILIC メソッド開発 | Thermo Fisher Scientific

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HILIC メソッド開発には体系的なアプローチがお勧めです。メソッドパラメータを一つずつ検討し、順番に調整します。以下の順序を推奨します。

検体特性を明らかにします。
最も適切なカラム固定相のタイプを選択します。
最も適切な移動相の開始条件を選択します。
移動相を最適化します。
カラム形状を最適化します。

HILIC メソッド開発のワークフロー

検体の物理化学的な特性を把握することは、最適な HILIC カラムを選択するために不可欠です。 log P、log D、pKa データの組み合わせは、固定相の選択プロセスの指針となります。

HILIC は、一般に負の log P 値の化合物に対して推奨されます。もう一つの重要な検体パラメータは、pK_a (-log K_a) 値です。K_a は分子の酸性を示します。pK_a 値が大きいほど、酸は弱くなります。log D は、特定 pH の溶液に含まれる化合物のイオン化状態を効果的に示します。log D には、log P よりも緩衝状態の疎水性特性が明確に反映されます。

以下の 8 種類のカラムから選択します。

これらのカラムの詳細については、固定相ページを参照してください。

HILIC において、移動相は有機性が高くなります（一般にアセトニトリル 60 ～ 70％超）。カラムの選択性とともに、有機溶媒濃度/水性比は保持力を制御する主要因になります。アセトニトリル濃度が 60 ～ 90％の場合は、有機溶媒の比率が上昇すると保持力が高くなります。アセトニトリルの含有量が 60％未満の場合は、保持力が低下します。

以下の理由で、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなどの揮発性バッファーの使用をお勧めします。

良好なピーク形状の維持
荷電化検体の保持力の制御
MS 検出との互換性の確保

一般的な HILIC 標準メソッドとして、UV 検出を使用する場合は、3 ～ 5 µm 粒子で充填された、内径 4.6 mm、長さ 100 または 150 mm のカラムを選択します。HILIC を MS または CAD 検出と併用する場合は、3 ～ 5 µm 粒子で充填された、100 x 2.1 mm や 50 x 2.1 mm といった小さめのカラムを使用します。カラムの長さを短くする前に、サンプルの複雑さと検出器の選択性をまず考慮してください。分離効率と分解能を高めるには、2 µm 未満の完全多孔質粒子を使用するか、ソリッドコア素材のカラムまたは長いカラムを使用することをお勧めします。

カラム寸法や粒子サイズが同じでも、検体の運動や固定相による違いはありますが、一般に HILIC カラムは逆相と同じか若干遅い流速になります。