このセクションは、HPLC カラムと装置のトラブルシューティングを網羅していませんが、HILIC 分離で発生する一般的なクロマトグラフィー問題の理解と解決を促進することを意図としています。

一般的な問題、考えられる原因、考えられる解決策

Insufficient Analyte Retention
考えられる原因是正措置
誤った固定相の選択

荷電検体の最適な保持力を確保するには、検体の log P または log D 値を固定相の極性度と一致させることが重要です。

酸性検体の場合、陰イオン交換特性のある固定層により、保持力が向上します。塩基性検体の場合、陽イオン交換特性のある固定相により、保持力が向上します。

移動相
バッファー pH		検体の保持力を高めるには、検体が荷電化される移動相バッファー pH を選択します。移動相バッファー pH は、固定相の荷電にも影響します。
移動相の水含有量が多すぎる移動相の有機物の割合を高めます。HILIC の分離効果を保つには、最低水含有量の 3％をお勧めします。
考えられる原因是正措置
カラムが完全に平衡化されていないHILIC カラムは、短い平衡時間への耐性が RPLC カラムより低いです。これは主に、固定相内の水性層に含まれる水が移動相から抽出され、その確立に時間がかかるためです。これはグラジエント条件では特に顕著です。約 20 カラム分のグラジエント後の再平衡化をお勧めします。
高速 HILIC グラジエントや 100％有機状態から 100％水性状態へのグラジエントはお勧めしません。新しいカラムには調整が必要です。移動相で約 20 カラム分実行することをお勧めします。
カラムの汚染想定レベルを超える急激な動作圧力の上昇に関連して、ピーク保持や分解能のシフトが生じる場合は、カラムの汚染が考えられます。インレットフリットに詰まった破片を除去するために、カラムの流れ方向を逆にしてみます（HPLC システムの汚染を防ぐためにカラム排出口は廃棄してください）。
カラムに詰まったしつこい汚れを除去するには、メタノールと水が 50：50 の溶媒など、強力な溶媒でカラムを逆方向に洗浄してください。
移動相移動相バッファーの pH が検体の pKa に近い場合、保持時間のドリフトが生じることがあります。バッファーの pH を調整するか、別のバッファーを選択してください。
Poor Peak Shape
考えられる原因是正措置
注入溶媒（サンプル溶媒）が移動相向けには強すぎる良好なクロマトグラフィー結果を得るには、サンプル溶媒の条件を初期移動相条件にできるだけ近づけるか、少なくとも 50％超の有機含有量を確立することをお勧めします。溶解強度の高い水性サンプル溶媒を使用すると、検体の固定相への分離が困難になり、良好な結果が得られず、ピーク幅が広くなります。その結果、カラムが過負荷になり、保持力が低下して、分解能が低下します。
極性検体は有機溶媒では溶解性が低くなる場合が多いため、水をメタノールに置き換えることをお勧めします。溶解度の問題が極端な場合は、移動相の水性分を極性非水性溶媒に置き換えることができます。その場合、「非水性 HILIC クロマトグラフィー」という分析法になります。
シリンジ／ニードルの洗浄が移動相と一致しないシリングや注入ニードルの洗浄に使用する溶液は、バッファーなしで移動相化合物と一致させる必要があります。洗浄に水を使いすぎると、望ましくないバンドの広がりが発生します。また、高純度の有機溶媒は検体を除去するだけの極性を持たないため、避けるべきです。
注入量が多すぎる過剰なサンプル量を注入すると、カラムの過負荷を招き、ピーク幅の拡大やテーリングピークが発生したり、極端な場合はフラットピークが発生します。推奨される注入量は、内径 2.1 mm のカラムで 0.5 ～ 5 µL、内径 4.6 mm のカラムで 5 ～ 50 µL です。
移動相のバッファーが不十分バッファーの濃度が不十分な場合、二次相互作用が増加してピークテーリングが発生します。バッファーの濃度を上げることで、検体と固定相の間の水素結合が強化され、他の二次相互作用を除外してピーク形状を改善できます。バッファーの濃度を上げる場合は、質量分析でのイオン信号が抑制される可能性があることを留意してください。
検体保持力の不足
Insufficient Analyte Retention
考えられる原因是正措置
誤った固定相の選択

荷電検体の最適な保持力を確保するには、検体の log P または log D 値を固定相の極性度と一致させることが重要です。

酸性検体の場合、陰イオン交換特性のある固定層により、保持力が向上します。塩基性検体の場合、陽イオン交換特性のある固定相により、保持力が向上します。

移動相
バッファー pH		検体の保持力を高めるには、検体が荷電化される移動相バッファー pH を選択します。移動相バッファー pH は、固定相の荷電にも影響します。
移動相の水含有量が多すぎる移動相の有機物の割合を高めます。HILIC の分離効果を保つには、最低水含有量の 3％をお勧めします。
保持時間のドリフト
考えられる原因是正措置
カラムが完全に平衡化されていないHILIC カラムは、短い平衡時間への耐性が RPLC カラムより低いです。これは主に、固定相内の水性層に含まれる水が移動相から抽出され、その確立に時間がかかるためです。これはグラジエント条件では特に顕著です。約 20 カラム分のグラジエント後の再平衡化をお勧めします。
高速 HILIC グラジエントや 100％有機状態から 100％水性状態へのグラジエントはお勧めしません。新しいカラムには調整が必要です。移動相で約 20 カラム分実行することをお勧めします。
カラムの汚染想定レベルを超える急激な動作圧力の上昇に関連して、ピーク保持や分解能のシフトが生じる場合は、カラムの汚染が考えられます。インレットフリットに詰まった破片を除去するために、カラムの流れ方向を逆にしてみます（HPLC システムの汚染を防ぐためにカラム排出口は廃棄してください）。
カラムに詰まったしつこい汚れを除去するには、メタノールと水が 50：50 の溶媒など、強力な溶媒でカラムを逆方向に洗浄してください。
移動相移動相バッファーの pH が検体の pKa に近い場合、保持時間のドリフトが生じることがあります。バッファーの pH を調整するか、別のバッファーを選択してください。
ピーク形状が不十分
Poor Peak Shape
考えられる原因是正措置
注入溶媒（サンプル溶媒）が移動相向けには強すぎる良好なクロマトグラフィー結果を得るには、サンプル溶媒の条件を初期移動相条件にできるだけ近づけるか、少なくとも 50％超の有機含有量を確立することをお勧めします。溶解強度の高い水性サンプル溶媒を使用すると、検体の固定相への分離が困難になり、良好な結果が得られず、ピーク幅が広くなります。その結果、カラムが過負荷になり、保持力が低下して、分解能が低下します。
極性検体は有機溶媒では溶解性が低くなる場合が多いため、水をメタノールに置き換えることをお勧めします。溶解度の問題が極端な場合は、移動相の水性分を極性非水性溶媒に置き換えることができます。その場合、「非水性 HILIC クロマトグラフィー」という分析法になります。
シリンジ／ニードルの洗浄が移動相と一致しないシリングや注入ニードルの洗浄に使用する溶液は、バッファーなしで移動相化合物と一致させる必要があります。洗浄に水を使いすぎると、望ましくないバンドの広がりが発生します。また、高純度の有機溶媒は検体を除去するだけの極性を持たないため、避けるべきです。
注入量が多すぎる過剰なサンプル量を注入すると、カラムの過負荷を招き、ピーク幅の拡大やテーリングピークが発生したり、極端な場合はフラットピークが発生します。推奨される注入量は、内径 2.1 mm のカラムで 0.5 ～ 5 µL、内径 4.6 mm のカラムで 5 ～ 50 µL です。
移動相のバッファーが不十分バッファーの濃度が不十分な場合、二次相互作用が増加してピークテーリングが発生します。バッファーの濃度を上げることで、検体と固定相の間の水素結合が強化され、他の二次相互作用を除外してピーク形状を改善できます。バッファーの濃度を上げる場合は、質量分析でのイオン信号が抑制される可能性があることを留意してください。
関連製品
Resources
Support
Style Sheet for Global Design System
CMD Wide-format style fixes
Style Sheet for Global Design System
Style Sheet for Komodo Tabs