抗体のアイソタイピングおよび特性評価

抗体のスクリーニング、力価測定およびアイソタイピングは、あらゆるカスタム抗体生産プロジェクトにおいて、重要なインプロセス型および最終決定型の抗体テスト手順です。これらのテストにより、どの免疫化動物または細胞株を選択・継続するか、特定の用途においてどの希釈液および二次試薬を使用すべきか、また効果的な抗体精製法を決定するために必要な情報データが得られます。

• スクリーニング—抗原結合特異性を持つ抗体サンプルの同定
• 力価測定—抗体濃度と機能アッセイ力価の測定
• アイソタイピング—モノクローナル抗体のクラスおよびサブクラスの属性の決定

本ページでは、これらの抗体の特性評価法について説明します。

ハプテン特異的抗体をアッセイするスクリーニング法の開発は、全ての抗体産生手順において重要な要素となります。スクリーニングは、免疫化スケジュールの最初の定期的な試験採血 (血清) 時に実行し、高レベルで抗原特異的ポリクローナル抗体を産生する免疫動物を同定します。モノクローナル抗体の開発用 (採取した脾臓細胞を融合しハイブリドーマを生成させる) のマウスを選択・処理した後、得られた数百から数千のモノクローナル細胞株を試験して、目的の特異的抗体を産生させる細胞株を決定します。

血清サンプル (試験採血) を用いたポリクローナル抗体のスクリーニングや、細胞培養上清を用いたモノクローナル抗体のスクリーニングは、最終的に抗体産生するアプリケーションが目的でない場合でも、通常ELISA法により実行します。抗体開発の後期段階 (例えば、モノクローナル抗体を作製する融合体用のマウスを選択する直前) では、スクリーニングで同定された陽性サンプルは、 特定アッセイにおける性能に関してさらに徹底的なテストを行うことができます。

抗体スクリーニング用の標準ELISA法：

1. pH 9.4の炭酸-重炭酸バッファー中で一晩インキュベートすることにより、イムノアッセイ (ポリスチレン) マイクロプレート中の精製抗原にコーティングを施します。(下記の重要コメントを参照)
2. 適切な試薬を用いて、プレートウェルの洗浄とブロックを行います。
3. テストウェルへ 1 種から数種の免疫血清の希釈液を添加し、別のウェルへ正常 (免疫前) 血清の希釈液を添加します；プレートをカバーし、1 時間インキュベートして抗体を結合させます。
4. プレートウェルを洗浄します。適切な酵素標識検出用二次抗体を添加して、プレートを 1 時間インキュベートして結合を起こさせます。通常 IgG の選択が目的であり、この場合、マウス血清サンプルに適した二次抗体は抗マウス IgG になります。
5. 最後に、プレートを洗浄し、適切な基質 (例えば、HRP 標識二次抗体用の TMB など) を添加することで、有効な結合酵素を検出します。

抗原 (ハプテン) が小ペプチドである場合、受動吸着の標準的コーティング条件を適用しても、抗原がマイクロプレートウェルへ効果的に結合しないことがあります。免疫化のためにキャリアタンパク質へ結合させたペプチド抗原は、通常マイクロプレートに結合します。しかし、免疫動物由来の抗血清には、ハプテンおよびキャリアの両方に対する抗体が含まれています。そのため、ハプテン特異的抗体とキャリア特異的抗体を識別するには、免疫原結合体の調製に用いられるのと同じ結合化学 (例：マレイミド) によって、ハプテンを無関係のキャリアタンパク質に結合させます。例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) やオボアルブミン (OVA) は、免疫原として mcKLH を使用した際の抗ペプチド抗体力価の評価に、無関係キャリアタンパク質として一般的に使用されています。また、アミノ基やスルフヒドリル基を介したペプチドの共有結合固定化には、活性マイクロプレートを使用します。

イムノアッセイにおいて、適正かつ再現性高く抗体標識や抗体を活用するには、精製抗体の濃度および機能力価を正確に測定することが研究者に求められます。"抗体濃度"と"抗体力価"の意味はそれぞれ異なります：

• 濃度—機能性に関わらず、溶液中の抗体 (タンパク質) 総量
• 力価—所定イムノアッセイにおける機能的濃度または抗体ストック溶液の希釈倍率

サンプルの精製方法によりますが、インタクトで有効な抗原結合抗体の占める割合は、測定された総タンパク質濃度または全抗体濃度のわずか数%のみです。抗体濃度は、標準タンパク質アッセイまたは免疫グロブリン特異的な手法のいずれかで推定することができます (下記の微小凝集アッセイを参照)。

抗体価は、濃度に関連しますが、厳密には所定抗体サンプルの有効力価を指しています。一般的に、力価測定とは、ELISA などの所定アッセイでの検出に必要な抗体サンプルの機能的希釈度を測定することを指します。ELISAによりスクリーニング (上述) を実行すると、必ずいくつかの力価情報が得られます (特に、複数のサンプル希釈液をテストした場合)。しかし、スクリーニングアッセイの特定の構造と形式は、通常、最終的に抗体を作製する目的の用途には対応していません。

濃度および力価に関する知識は、後続アッセイの開発時や新たな産生抗体の使用時に重宝します。

純粋な抗体の濃度は、280 nm で測定した吸光度から推定できます; 生理食塩水またはPBS中の溶液 1% (10mg/mL) の吸光度値は、13～14 と仮定します。

また、弊社製品の BCA Protein Assay Kit や Coomassie Plus Protein Assay Kit などの市販タンパク質アッセイを用いて、純粋な抗体の濃度を推定することもできます。あらゆるタンパク質アッセイにおいて、通常のウシ血清アルブミン (BSA) に代わり、弊社製品 Bovine Gamma Globulin Standard (BGG) などの免疫グロブリン標準サンプルを使用することが推奨されます。これは、BSA はタンパク質混合物に正確な"平均"基準を提供する一方で、 全タンパク質アッセイ法において免疫グロブリンとは異なる応答を示すことに起因します。

通常、抗体は半精製状態で産生、回収、または意図的に保存されます。一般的に抗体溶液は、タンパク質安定化添加剤 (例: BSAまたはゼラチン) を含有している場合、あるいは共精製された血清タンパク質 (例: トランスフェリン、アルブミン) および免疫グロブリンクラスなどを保持している場合があります。全タンパク質アッセイでは、目的抗体とこうした他のタンパク質の区別を行いません。

弊社の Easy-Titer IgG Assay Kits は、シンプルな調合済み既製アッセイであり、インタクトな抗体の特定の種およびクラスの濃度を正確に測定できます。特異的な抗 IgG または IgM ポリクローナル抗体でコーティング ("感作された") された微粒子の凝集を用いて、特異的な標的抗体の検出と測定を行います。適切な水性バッファー (キット付属) 中において、単分散型の抗体でコーティングされた微粒子 (>直径 1 µm 以上) は、その直径の約半分に相当する波長 (340 nm) の入射光に対して、最大吸光率 (λ-max) を持ちます。サンプル添加時に、複数の微粒子が、コーティングされた特異的ポリクローナル抗体を介して各抗体標的へ結合します。この凝集の結果、吸光率が比例的に減少 (吸光度の低下) します。

力価とは、上述の通り、所定アッセイ法において最低限レベルの特異的検出達成に必要となる、抗体サンプルの機能希釈 (または作業濃度) として定義されます。正確な最小許容値は、研究者自身により設定されますが、通常は統計的に有意なシグナル対ノイズ比を基準にして定義されます。

抗体価とは、アッセイ固有の測定指標です。例えば、1:10000 希釈の抗体価を産出可能な免疫プロトコルもあれば、わずか 1:5000 希釈の抗体価しか産出できないプロトコルもあります。また、同じアッセイでテストした 2 種類の抗血清の出血についても、一方の出血が他方より高力価を有していることがあります。希釈係数が高いほど、ポリクローナル免疫応答（抗体の量または特異性）が強力になります。

全ての所定抗体 (クローン) において、力価は濃度と強く相関しています。つまり、所定モノクローナル抗体の 2 種類の産生バッチおよび精製バッチがお互い異なる力価を有することが判明した場合、一方のバッチが他方よりも濃縮度が高いことを意味しています。また、一方のバッチ中の抗体が、他方のバッチ中の抗体よりも不活性化 (変性、分解) が進行している可能性もあります。

力価の差異は、異種の抗体 (別のクローン) に関して、濃度差にほとんど相関しないことがあります。ある抗体の有する特異性と抗原親和性は、他の抗体よりも高いことがあります。

アイソタイピングでは、モノクローナル抗体のクラス (例: IgG または IgM) およびサブクラス (例: IgG2a または IgG1) の決定を行います。抗体の精製法や修飾法を適切に選ぶうえで必要とされるアイソタイピングは、抗体産生の重要なステップと言えます。市販のすぐに使用可能な抗体アイソタイピングキットを利用すれば、アイソタイピングはごく簡単に実施できます。標準的アイソタイピングキットには、所定種 (例: マウス) の抗体について以下のクラスとサブクラスが用意されています：IgG、IgG2a、IgG2b または IgG3、IgA、あるいは IgM。また、κ 軽鎖または λ 軽鎖を有したクラスとサブクラス。

イムノアッセイにおいて抗体の精製法と使用法を決めるには、抗体のクラスとサブクラスの同一性を測定することが非常に重要です。例えば、抗体が IgM と判定された場合、プロテイン A または G では有効な精製ができず、おそらく免疫組織化学的手法で使用するためには抗体を断片化させる必要があるでしょう。モノクローナル抗体が κ 軽鎖 (VL-κ) から成る IgG1 と測定された場合、 血清サプリメント由来のウシ免疫グロブリンからのコンタミネーションを受けずに、固定化プロテインLを用いて培養上清から抗体を精製できる可能性が高くなります。

アイソタイピングで使用する特異的抗免疫グロブリン抗体は、抗体産生で遭遇するモノクローナル抗体の種々のクラスおよびサブクラスを検出できる抗体でなくてはなりません。このため、アイソタイピングの実行には市販キットを利用するのが最も手軽です; 大スケールで抗体産生を実施するケースを除いて、必要な複数の抗体を別個に取得する方法は全く実用的ではありません。

標準的アイソタイピングキットには、所定種 (例: マウス) の抗体について以下のクラスとサブクラスが用意されています：

• IgG、IgG2a、IgG2b または IgG3、IgA あるいは IgM
• VL-κ または VL-λ のいずれかの軽鎖

アイソタイピングキットには、次の 2 種類の基本フォーマットがあります：ELISA キットまたはメンブレンキット (ストリップ方式またはカセット方式)。通常これらのキットには、 テストサンプルからの抗体を直接捕捉し反応する性能を備えた、コーティング済みのプレートまたはメンブレンが付属します。ELISA キットは、対応したコーティング済みのアイソタイプ特異的抗体を含む、特定マイクロプレートウェルへ試験抗体を捕捉します; 一般的な抗免疫グロブリン抗体によって、試験抗体が捕捉されたウェルの最終検出が可能になります。カセット方式キットは、メンブレン上でドット状のアイソタイプ特異的な抗体が試験抗体と反応して、有色バンドを生成します。カセット方式キットは、一回のテストで 1 個のサンプルを試験する場合に迅速な処理が可能です；ELISA キットは、複数のサンプルを同時に試験する場合にハイスループットを提供します。

最も便利で迅速なアイソタイピングキットは、実質的に純粋なモノクローナル抗体を使用して行うよう設計された抗原非依存型アッセイです。抗体の複数のクラスまたはサブクラスが測定可能レベルでサンプル中に存在する場合、抗原特異性に関わらず、これらのアッセイキットによりほぼ均等にこれらの抗体が検出されます。

研究者自身が所要のアイソタイプ特異的抗体を保有している場合、ELISA フォーマットで抗原依存性アイソタイピングを実行できます (ただし、この種のアイソタイピングが必要となるケースは稀です)。まず、抗原をマイクロプレートにコーティングします。続いて、抗体試験サンプルを全ウェルへ添加して、抗原特異性結合を生じさせます。次に、洗浄を行い、抗原特異性成分以外の全サンプル成分を除去します。最後に、アイソタイプ特異的検出抗体を別のウェルに添加した後、適切な二次抗体により検出します。この際、使用するアイソタイプ特異的抗体には、試験サンプルとは異なる宿主種に由来した抗体を選ぶことが重要です。