細胞シグナル伝達ELISAキットおよびマルチプレックスイムノアッセイ

図2：AKT ELISAを用いたJurkat細胞における総AKTとリン酸化AKTの測定。Jurkat細胞を、さまざまな濃度（0~500 nM）のwortmannin（PI -3キナーゼ阻害剤）で処理しました。細胞を溶解し、AKT (Total) Human ELISA Kit (カタログ) 番号KHO0101)およびAKT (Phospho) [pS473] Human ELISA Kit (カタログ番号KHO0111)を用いて、それぞれAKT [トータル]およびリン酸化AKT [pS473]を同時に測定しました。このグラフは、AKTの総量は同等であったが、セリン473でのリン酸化レベルは、Wortmanninの増加に伴って用量依存的に減少したことを示しています。

図3.AKT [pS473] ELISAの特異性。AKT[pS473]の特異性を確認するために、ペプチド競合アッセイを実施しました。AKT [pS473]のリン酸化に対する特異的ブロッキングペプチドの滴定は、AKT (Phospho) [pS473] Human ELISA Kit（カタログ番号KHO0111）を用いて測定しました。このグラフは、セリン473を囲む領域に対応するペプチドのみがELISAシグナルをブロックしていることを示しています。

図4.AKT [pS473] ELISAの分析感度。Jurkat細胞を最適条件下で培養し、リン酸化AKT細胞抽出物を得ました。リン酸化AKT [pS473]の刺激を、}AKT (Phospho) [pS473] Human ELISA Kit（カタログ 番号KHO0111）およびウェスタンブロッティングで測定しました。AKT [pS473] ELISAの分析感度は, ゼロ標準で30回のアッセイから得られた平均O.D.に2つの標準偏差を加えて決定しました。 <0.8 Units/mLの値は、4,000個のJurkat細胞から抽出されたAKT [pS473]の量に相当します。その結果、既知量のAKT [pS473]を用いて試験した場合、ELISAの感度はウェスタンブロットの感度よりも約2倍高いことが示されました。

図5.InstantOne ELISAを使用したHEK293細胞中のヒトp38 MAPK [pT180/pYの検出182]。HEK293細胞を2 µ g/mLのAnisomycin（p38/JNK MAPK経路の強力な活性化因子）で30分間処理しました。未処理のHEK293細胞（-）をネガティブコントロールとしました。これらの細胞を、p38 MAPK (Phospho) [pT180/pY182] Multispecies InstantOne ELISA Kit（カタログ番号85-86022-11)を用いてウェスタンブロット法（右）とELISA法（左）で分析しました。イムノブロットで検出された38 kDaのバンド強度は、InstantOne ELISAの吸収値と相関しています。

図6.InstantOne ELISAを使用したC2C12細胞中のSMAD1（総/リン酸）の検出。C2C12細胞をDosomorphin（50 mM）で60分間阻害（-）するか、BMP4（10 ng/mL）で30分間刺激（+）しました。ライセートは、InstantOne ELISAユーザーマニュアルに従い調製しました。細胞（10 µ g/アッセイ）は、SMAD1 (Total/Phospho) InstantOne ELISA Kit（カタログ 番号85-86183-11）を用いて、total SMAD1（左）またはリン酸化SMAD1 [S463/S465]（右）について解析しました。

A） ProcartaPlexアッセイ用のLuminexビーズは、リン酸化状態に関係なく、シグナル伝達タンパク質に特異的に結合する捕捉抗体と結合します。固有の番号で識別できるビーズに特異的抗体を結合させることで、1ウェルで複数の分析物を分析することができる。レポーターチャンネル1（532 nm）用のPE色素を用いた非リン酸化特異的検出抗体またはリン酸化特異的検出抗体を使用して、総タンパク質またはリン酸化シグナリングタンパク質のマルチプレックス分析用に別々のパネルが作成されており、すべてのLuminex装置でご利用いただけます。

（B） ProcartaPlexデュアルレポーターアッセイの場合は、同じ捕捉抗体が適用されますが、リン酸化シグナリングタンパク質の定量には、Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE装置の追加レポーターチャンネル2（405 nm）を利用する、BV421結合を持つリン酸化特異的検出抗体を使用します。総タンパク質は、PE色素を使用したレポーターチャンネル1（532 nm）を介して検出されます。このアプローチでは、同一のビーズ上の1つのウェルで総タンパク質とリン酸化タンパク質の両方を同時に定量できます。

図7.ProcartaPlexシグナル伝達アッセイと従来のELISAとの相関を示す比較データ。さまざまな細胞株のライセートをデュプリケートで使用し、ProcartaPlex Signaling Simplex kits（カタログ番号EPX010-97101-PHO、カタログ番号EPX010-97106-PHO、カタログ番号EPX010-97102-PHO）およびELISAキット（カタログ番号KHO0111、カタログ番号KHO0421、カタログ番号KHO0241）を用いて同時に解析しました。Akt [pS473]、PRAS40 [pT246]、およびCREB [pS133]の測定濃度データは、高い相関を示しています（R2 > 0.8）。このことは、ProcartaPlex Signaling Simplexキットが従来のELISAキットと同等の定量結果を達成することを示しています。サンプル量の削減、アッセイ/ハンズオン時間の短縮、データポイントあたりのコストの削減など、マルチプレックス機能のさらなる利点があります。

図8.ProcartaPlexとウェスタンブロットの比較データ。ウェスタンブロットおよびProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex（カタログ番号EPX080-97200-DR）は、2つのアッセイシステム間で高い相関性を示します。ウェスタンブロットデータは、溶解したNIH-3T3細胞におけるPRAS40 [pT246]レベル（40 kDa）を示しています。同量のタンパク質（10 μ g）をウェスタンブロットおよびProcartaPlexアッセイに使用しました。ProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex（カタログ番号EPX080-97200-DR）は、ユーザーガイドに従って実行しました。ウェスタンブロット解析では 、Bolt 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gels 17slots （カタログ番号 NW04127BOX）、 XCell SureLock Electrophoresis System（カタログ番号 EI0002）および PageRulerPlus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa（カタログ番号 26619)を用いて、タンパク質サンプルを電気泳動しました。溶解したタンパク質は、ニトロセルロースメンブレンiBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose（カタログ番号 IB23002）上に、iBlot 2 Dry Blotting Systemで転写しました。メンブレンはiBind Solution Kit（カタログ番号SLF1020）を用いてブロッキング後、関連する一次抗体と二次抗体でプローブしました。化学発光検出は、SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate（カタログ番号34577）を用いて行いました。

図9.ProcartaPlexシグナル伝達アッセイとウェスタンブロットの分析感度の比較。Jurkat細胞を最適増殖条件下で培養し、細胞ライセートを使用してリン酸化CREBを測定しました。同量（10 µg）のタンパク質を1：2の連続希釈に使用し、ProcartaPlex CREB [pS133]Simplex kit（カタログ番号EPX010-97102-PHO））を用いてウェスタンブロットアッセイで測定しました。ウェスタンブロットでは、シンプレックスキットに含まれているものと同じPRAS40 [pT246]に対するリン酸化特異的検出抗体を使用しました。ウェスタンブロットで測定した最低濃度は5 μ g／ウェルで、ProcartaPlexシンプレックスキットで測定した最低濃度は0.6 µg／ウェルでした。

図10.従来のProcartaPlexとProcartaPlexデュアルレポーターフォーマットの相関。ProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex（カタログ番号EPX080-97200-DR）を、ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total), 8plex（カタログ番号EPX080-97000-901）およびProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (phospho), 8plex（カタログ番号EPX080-97100-PHO)と共に使用して、Aktシグナル伝達経路に関与する総タンパク質またはリン酸化タンパク質を評価しました。得られたデータは、デュアルレポーターパネルと、総タンパク質またはリン酸化タンパク質（R² > 0.9）の従来のパネルとの間に強い相関を示しています。