バックグラウンド蛍光の原因と低減方法

バックグラウンド蛍光を低減させるために実行可能なこと。

蛍光画像から最良のデーターを取得するためには、シグナル（蛍光標識されることが望ましいもの）とバックグラウンド（蛍光標識されることが望ましくないもの）の差をできる限り大きくするために最大限努力することが必要です。その差は、定量結果を報告する際に、シグナルとバックグランドの差を∆F、バックグラウンドをFとした場合、∆F/Fという比として表現されることもあります。なるべく輝度の高い蛍光色素を使用したいと考えるのは当然ですが、最良の結果を得るためには、バックグラウンドまたはターゲットから外れた蛍光をできるだけ少なくすることも必要です。一般的には、バックグラウンドを低減させると、画像のコントラストが向上し、目的とするシグナルの観察がより容易となります。 

サンプル中の非結合性の色素または非特異的に結合している色素に由来するバックグラウンド蛍光

• 洗浄：蛍光色素または染色剤でサンプルを標識した後、サンプルをPBSなどの緩衝生理食塩水で2～3回洗浄します。この操作により、非結合性の蛍光色素が除去され、バックグラウンドが低減されます。
• 蛍光色素濃度の至適化：サンプルを使用している蛍光色素で、滴定法により標識します（例を参照してください）。示唆される濃度よりも低い濃度、同じ濃度および高い濃度を使用してください。実験条件に最適な色素濃度を使用することにより、輝度の高い特異的なシグナルを、最低限のバックグラウンドシグナルの存在下において取得することが可能となります。

図2. 同一の実験条件下において、異なる色素濃度を使用すると、極めて異なる量のバックグラウンドが得られます。

異なるフィルターとマッチする色素で標識してください。

サンプル自体が、シグナルを不明瞭にさせる蛍光を発光している場合には（自家蛍光）、異なるフィルターセットにマッチする色素での標識を試みてください（例えば、緑色フィルターセットを使用する蛍光色素から、赤色または近赤外のフィルターセットを使用する蛍光色素に変更する）。 

細胞および薬物または処理剤のみを含むウェルからの蛍光強度を測定してください。

細胞および薬物または処理剤のみを含む（蛍光標識を含まない）ウェルからの蛍光強度を測定することにより、生細胞観察において、細胞処理方法がバックグラウンドの上昇に寄与しているかどうかを同定することが可能です。もしその寄与が存在する場合には、結果からこのバックグラウンドを差し引くことも可能です。あるいは、異なるチャネルを使用する、異なる処理方法または色素を使用することが必要になる場合もあります。

媒体を確認する

サンプルを保持している媒体が結果に影響を与えている場合もあります。固定化細胞および生細胞のいずれの観察においても、この可能性は存在します。免疫染色を最も一般的に使用する、固定細胞の観察においては、封入剤の検討を試みるとよいかもしれません。生細胞観察においては、蛍光を発光するタンパク質やビタミンなどを含む完全培地を使用する代わりに、光学的に透明な緩衝生理食塩水中での観察を行うと、シグナル対バックグラウンドの比が改善します（生細胞を用いた蛍光観察を参照してください）。 

容器を確認する。

観察を行う容器もバックグラウンド蛍光に寄与する可能性があります。例えば、細胞培養で一般的に使用されるプラスチック底の培養皿は、非常に輝度の高い蛍光を発する可能性があります。過剰なバックグラウンド蛍光が存在し、観察をプラスチック底の容器で行っている場合には、ガラス底の容器の使用への変更を試みてください。