生細胞蛍光イメージングにおける光毒性とその低減方法

問題点

タイムラプスイメージング中に、生細胞が病的で不健全な状態になってしまう

細胞は、蛍光色素を励起するための低波長および高波長の光のどちらによってもダメージを受けます。研究に使用されるほとんどの細胞は、一般的なイメージング実験中に細胞へ照射される光子数に耐えられるように適応していません。

観察を行っている間に、培養容器からの細胞の剥離、細胞膜の小疱形成または大きな空胞の形成、ミトコンドリアの肥大化、あるいは 蛍光タンパク質の凝集が見られた場合、これらは全て細胞がストレスを受け、不健全な状態にあることを示す兆候です。

図 1. 図の上部にある細胞では、細胞膜が 末期的な小疱形成を起こしていますが、隣接する細胞は比較的健全な状態を保っています。

さらに、光励起した蛍光色素は活性酸素種を放出し、近接する細胞構造を損傷します。

図 2. 上段： CellLight® H2B-GFP 試薬により形質導入したHeLa生細胞の画像、明視野および 緑色チャンネルのオーバーレイ。 この画像を撮影するまでに、Illuminated areaの細胞は10時間繰り返し照明を当てられていますが、Non-illuminated areaの細胞はこの画像を撮影した時にのみ照明を当てています。 繰り返し照明にさらされた細胞では、GFPシグナルの低下と消失が見られ（緑色チャンネル画像）、同時に細胞の収縮、細胞の円形化、およびミトコンドリアの肥大といった明らかな細胞損傷が見られます（明視野画像）。 下段： CellTracker® Deep Red試薬を添加したHDFn 細胞カルチャーにおける擦過痕。 Illuminated areaには、10時間繰り返し照明が当てられました。 Illuminated areaの細胞はバイアビリティーの喪失を示しており、擦過痕には細胞が増殖していませんが、Non-illuminated areaの細胞は擦過痕に細胞が増殖しています。

上記の現象はどちらも光毒性と呼ばれており、両者を区別しない場合もあります。光毒性に対する主な対策は、顕微鏡の設定および実験条件を最適化し、必要最小限の照明を使用することです。