エンドサイトーシスおよび飲作用

蛍光タンパク質は、初期エンドソーム、後期エンドソームまたはリソソームなどのエンドサイトーシス経路における構成要素を特異的に標識するのに用いることができます。BacMamテクノロジーを利用し、RFPまたはGFP融合タンパク質をトランスジェニック発現させることで、細胞内の特異的な構造を標識します。生細胞、またはさらなる免疫組織化学的分析を行うために固定した細胞において、エンドサイトーシスの構造体をモニターすることができます。

BacMamテクノロジーは非常に有効で、一時的に形質導入された細胞では融合タンパク質が通常約5日間にわたり発現され、一部の主要細胞種などゆっくりと分裂する細胞であれば、発現が2週間まで認められます。

• 蛍光タンパク質については選択ガイドをご覧ください

HeLa細胞をCellLight® Early Endosmes-GFPとCellLight® Late Endosmes-RFPで同時形質導入し、一晩インキュベートしました。

液相エンドサイトーシスを解析するための汎用的な方法として、蛍光デキストランのインターナリゼーションの追跡が挙げられます。pHrodo™色素は、消光または洗浄を必要とせず初期エンドソームからリソソーム形成までのエンドサイトーシス経路におけるステージの識別を可能にすることにより、最も完全なソリューションをもたらします。

pHrodo™色素は中性のpHではほとんど蛍光を発しませんが、pHの低下に伴い赤色または緑色の蛍光シグナルの増強を示します。蛍光シグナルの増強により、エンドサイトーシス経路における進行をモニターすることができます。

Alexa Fluor®コンジュゲートは、消光または洗浄ステップのいずれかを行うことにより、インターナリゼーションのモニタリングに使用できます。

• デキストランコンジュゲートについては選択ガイドをご覧ください

マウス単球/マクロファージ細胞（MMM細胞、ATCC） は、Live Cell Imaging Solution中でpHrodo™ Redをコンジュゲートしたトランスフェリンによる処理を行い、NucBlue® Live ReadyProbes™試薬により対比染色をしました。

LysoTracker®プローブは、酸性オルガネラを有機色素で特異的に標識します。トランスジェニックタンパク質系は使用しません。 その安定した蛍光シグナルは、幅広い波長を網羅していますが、リソソームと他の酸性の小胞を区別することができません。

LysoTracker®プローブは、その他の色素またはタンパク質とマルチプレックス化することが可能です。LysoTracker® Deep Redは、特にRFPおよびGFPのいずれとも適切にマルチプレックス化することができます。

膜タンパク質とLysoTracker®色素は、いずれもリソソームの挙動を追跡するのに効果的なツールです。選択ガイドを利用してマルチプレキシングオプションと固定能を選択してください。

• LysoTracker®蛍光試薬についての選択ガイドをご覧ください

LysoTracker® Deep Redを使用した共局在確認

エンドサイトーシスを追跡できるさらなるツールは、膜プローブを使用しており、膜形態の変化を可視化することで小胞形成をモニターすることができます。

水溶性FM®蛍光試薬は、親油性で細胞に無毒であり、水性溶媒中では蛍光をほとんど発しません。これらの色素は、細胞膜の外層に挿入され、様々な色の蛍光を強く放ちます。FM®蛍光試薬は原形質膜を染色し、エンドサイトーシス小胞（エンドソーム） に取り込まれます。細胞表層膜の非特異的な染色試薬は、イメージングの前に洗い流すことができます。

FM® 1-43は、特に盛んに活動している神経細胞での活性依存的な小胞サイクリングの機序を調べるのに利用されます。

• 膜染色については選択ガイドをご覧ください

活性酸素種インジケーターである6-carboxy-2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate, di(acetoxymethyl ester)、FM® 5-95およびHoechst 33342で染色したウシ肺動脈内皮細胞。

赤色蛍光性のFM® 5-95は原形質膜および初期エンドソームの両方を染色しているように見え、緑色蛍光性の酸化型カルボキシジクロロフルオレセインは細胞質に局在しており、青色蛍光性のHoechst 33342色素は核を染色しています。