大腸菌形質転換ワークフロー–四つの主要ステップ

Bacterial Transformation Workflow–4 Main Steps

大腸菌形質転換はクローニングの重要なステップであり、その目的の一つは組み換え DNA 分子の多数のコピーを産生することです。組み換えプラスミドを作製するための前段階については、「従来型クローニングの基礎」に記載されていますが、目的 DNA 配列をベクターに挿入する必要があります。 形質転換では、DNA（通常プラスミド）をコンピテントセルに導入しますが、目的DNAは以後の実験に必要な量まで大腸菌内で増幅されます。

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大腸菌形質転換の四つの主要ステップは以下のとおりです：

コンピテントセルの調製
形質転換
回復期
プレーティング

Key steps in the process of bacterial transformation

図 1. 細菌形質転換プロセスの重要なステップ：（1）コンピテントセルの調製、（2）細胞の形質転換、（3）細胞の回収、および（4）細胞播種。

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コンピテントセル調製

大腸菌は、クローニングにおける形質転換で使用される最も一般的なバクテリアです。大腸菌の元来の DNA 取り込み能力は非常に低いため、熱処理または電気的処理により形質転換に相応しい状態にする必要があります。

コンピテントセル調製のプロトコルは、ヒートショックまたはエレクトロポーションのどちらで形質転換を行うかによって異なります。どちらの場合でも、目的の菌株の新鮮な単一コロニーを寒天プレートから採取し、前培養用の液体培地に接種します（図 2）。600 nm（OD₆₀₀）の吸光度を継続的に測定し、前培養と本培養の大腸菌の増殖を注意深くモニタリングします。高い形質転換効率を得るためには、採取時に大腸菌の増殖が対数期中期にあることが極めて重要です。通常、その増殖は OD₆₀₀ で 0.4 ～ 0.9 の間であり、最適値は培養容量、菌株およびプロトコルによって異なります。すべてのステップにおいて、必要に応じて滅菌済ツールや実験器具、培地および試薬の使用に注意を払わなければなりません。大腸菌回収後、細胞生存率を向上させ、形質転換効率を維持するために、すべてのサンプル、試薬および機器を 0 ～ 4℃に保つことを推奨します。

回収された細胞は、ヒートショックまたはエレクトロポレーションのどちらかの形質転換法に従って処理します（図 2）。

ヒートショック法：コンピテントセルは、大腸菌を塩化カルシウム（CaCl₂）で処理することにより、細胞膜の透過性を高めたものです [1,2]。能力をさらに高めるため、Hannah ら(1983) [3] が述べているように Ca²⁺に加えて、マンガン（Mn²⁺）、カリウム（K⁺）、コバルト（[Co(NH₃)₆]³⁺）、ルビジウム（Rb⁺）、ジメチルスルホキシド（DMSO）および／またはジチオトレイトール（DTT）など他のカチオンを使用する場合があります。
エレクトロポレーション：回収した大腸菌を、氷冷脱イオン水で数回洗浄することにより、エレクトロポレーションを妨げる可能性のある塩やその他の成分を除去します。3 ～ 4 回の洗浄後、最終的に大腸菌をペレット化し、10％グリセロールに再懸濁して保存します [4]。

Preparation of chemically competent and electrocompetent cells

図 2. ケミカルコンピテントセルおよびエレクトロコンピテントセルの調製。

調製後、コンピテントセルは、形質転換効率の評価、凍結／解凍サイクルを最小限に抑えるため少量に小分け、生存率を維持するために適切な温度での保存が必要です。通常、コンピテントセルの形質転換効率は、適量のスーパーコイル状プラスミド（例：10～500 pg の pUC DNA）の取込みによって評価されます。その結果は、使用したプラスミド DNA 1 マイクログラムあたり形成されたコロニー（形質転換体）の数、またはコロニー形成単位（CFU）として表されます（CFU/μg）（細胞播種を参照）。

保存については、凍結／解凍サイクルにより形質転換効率が約半分に低下するため、調製したコンピテントセルを、スクリューキャップ付き微量遠心チューブに 1 回使い切りの容量で小分けすることを推奨します。コンピテントセルは、温度変化を最小限に抑えて –70℃で保存した場合、約 6 ～ 12 ヵ月間使用可能です。また、生存率が大幅に低下するので、コンピテントセルを液体窒素中で凍結、及び保存しないでください。

市販されている既製のコンピテントセルはすぐに使える形で入手可能で便利です。一貫性を保ち、時間を節約する事ができます。これらのコンピテントセル、形質転換効率と遺伝子型の規格を満たすように品質管理されています。既製のコンピテントセルを使用すれば、ロット間変動が最小限に抑えられ、クローン化 DNA の効率的な増殖を大幅に簡便化できます。

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形質転換

大腸菌の形質転換の最も一般的な二つの方法は、(1) 化学的に調製されたコンピテントセルのヒートショック（ケミカルトランスフォーメーション）と、(2) エレクトロコンピテントセルのエレクトロポレーションです。必要な形質転換効率、実験目的、および装置を持っているかどうかによってどちらかを選ぶことになります（コンピテントセルの選択を参照）。形質転換ステップの準備ができたら、コンピテントセルを氷上で解凍しますが、慎重に取り扱い生存率を維持する必要があります。大腸菌は穏やかな振とう、タッピングやピペッティングにより混合できますが、ボルテックスは行わないでください。

ケミカルトランスフォーメーションの概要

形質転換の基本、2 種類のコンピテントセル、ケミカルトランスフォーメーションの実施方法、およびトラブルシューティングをご覧ください。

注：実験が手順通りに行われたかを評価するために、ネガティブおよびポジティブコントロールを同意に行う必要があります。

コントロール	サンプルの構成要素	評価
ネガティブ	大腸菌のみ DNA なし	バックグラウンドコロニーの形成プレート中の抗生物質の安定性
ポジティブ	大腸菌適切な選択マーカー（例：抗生物質耐性遺伝子）を持つ環状プラスミド	生存率形質転換効率プロトコルの成否
実験区	大腸菌目的の組み換え DNA	形質転換効率コロニースクリーニング

ケミカルトランスフォーメーションでは、ケミカルコンピテントセルをプラスミド DNA と混合し、高温に短時間曝露させます。これはヒートショックとも言われるプロセスです（図 3A）。最初に、ケミカルコンピテントセルを氷上のポリプロピレン製チューブ中でDNAとともに 5 ～ 30 分間インキュベートします。ポリスチレン製チューブはDNA が表面に付着して形質転換効率が低下することがあるので使用しないでください。昔からあるプロトコルでは、最良の結果を得るために、17 x 100 mm の丸底チューブが使用されています。1.5 mL 微量遠心分離チューブを使用すると、細胞懸濁液の表面積対容積比が小さくなるため熱分布が悪くなり、形質転換効率が 60～90%まで低下することがあります。

ケミカルトランスフォーメーションを成功させるために、50 ～ 100 μL のコンピテントセルと 1 ～ 10 ng の DNA を推奨します。ライゲーション反応液を形質転換 DNA として使用する場合（多くの場合、1 ～ 5 μL で十分）、通常、形質転換前に精製する必要はありません。スーパーコイル状プラスミド DNA による形質転換と比較して、ライゲーション反応液の場合形質転換効率が 1 ～ 10％と低くなる傾向がある点に注意が必要です。

ヒートショックは、使用する大腸菌株と DNA に応じて 37 ～ 42℃で 25 ～ 45 秒間行います。小さいチューブを使用して液量が少なくなるほど、ヒートショック時間を短くする必要があります。ヒートショックの時間は、大腸菌懸濁液の表面積対容積比に依存するためです。その後、次のステップに進む前に、ヒートショックを与えた細胞を 2 分間以上氷上に戻します（図 3A）。

図 3. （A）ケミカルコンピテントセルとヒートショック、および（B）エレクトロコンピテントセルとエレクトロポレーションを使用した細菌の形質転換。

エレクトロポレーションでは、エレクトロポレーション装置を使用して、コンピテントセルと DNA を高電圧電場の短いパルスに曝露させます（図 3B）。この処理により、細胞膜に一過性の細孔が開き、DNA が細胞内に侵入できるようになると考えられています（図 4）。大腸菌エレクトロポレーションで最も一般的なタイプの電気パルスは、指数関数的減衰であり、設定した電圧が加えられ、時定数と呼ばれる数ミリ秒間をかけて減衰します（図 4A）。印加電圧は、電界強度（V/cm）によって決まります。V は初期ピーク電圧、cm は使用するキュベットの電極間のギャップの測定値です。通常、細菌のエレクトロポレーションでは、0.1 cm キュベット（20 ～ 80 μL 容量）を使用し、15 kV/cm 超の電界強度が必要です。

図 4. （A）電気パルスの指数関数的減衰。（B）エレクトロポレーションのプロセス。

エレクトロポレーションの主な問題の一つは、細胞の生存率と形質転換効率を低下させる可能性のあるアーク放電または電気放電です。アーク放電は、MgCl₂ やリン酸塩を含有する緩衝液などの導電性緩衝液中でのエレクトロポレーションによってしばしば生じます。

アーク放電を防止する方策には以下のものがあります：

DNA 溶液とエレクトロポレーション反応液のイオン強度を最小限に抑えます。ライゲーション反応液は、カラムで精製し、水または TE バッファーに再懸濁し、エレクトロポレーションの前にタンパク質や塩を除去する必要があります。
DNA 溶液の容量を、細胞懸濁液の総容量の 5％以下にします（例：細胞 40 μL あたり DNA 2 μL）。
エレクトロコンピテントセルの調製時に寒天のキャリーオーバーが無いように気を付けてください。
エレクトロポレーションキュベット内に気泡がないことを確認してください。
コンピテントセルを直接キュベットの底部に分注します。

形質転換後、（いずれの方法のために調製された）未使用のコンピテントセルは再凍結が可能です。ただし、再凍結により形質転換効率が約 50％低下します。最良の結果を得るため、調製されたコンピテントセルを 1 回使い切りの容量で小分けすることにより、凍結融解を最小限に抑えられます。市販されている 1 回使い切りのフォーマットのコンピテントセルを使用すれば、同一チューブでの形質転換と回収が可能になり、細胞を凍結融解する必要がありません。未使用のコンピテントセルを再凍結するためには、ドライアイス／エタノール浴で 5 分間急速凍結し、–70℃で保存します。生存率が大幅に低下するので、液体窒素中でコンピテントセルを凍結または保存しないでください。

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回復期

ヒートショックまたはエレクトロポレーションのあとに、形質転換体を抗生物質フリーの液体培地で短時間培養することにより、取得したプラスミドから抗生物質耐性遺伝子の発現が開始します（図 5）。このステップにより、細胞生存率とクローニング効率が向上します。エレクトロポーションされた大腸菌の場合、エレクトロポレーション緩衝液は細胞の長期生存用に作製されていないので、できるだけ早く細胞を増殖させることをお勧めします。

回収ステップでは、形質転換細胞を、予め暖めた 1 m L の S.O.C. 培地で、37℃、225 rpmで 1 時間振とう培養します。グルコースと MgCl₂ を含有する S.O.C. 培地は、形質転換効率を最大にするために推奨します [3]。Lennox L 液体培地（LB 液体培地）の代わりに S.O.C. 培地を使用すると、形質転換コロニーの形成を 2～3 倍に増加させることができます [5]。このステップは、バクテリオファージ M13 ベクターを増殖させるための菌株には必要ありません。

図 5. 回収ステップ中の細胞増殖。

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プレーティングのヒント

S.O.C. 培地で培養した後、目的の形質転換体を選別するため、適切な抗生物質または他の薬剤とともに大腸菌を LB 寒天上にプレーティングします。たとえば、blue/white スクリーニングを行う場合、X-Gal と IPTG を寒天プレートに添加します。抗生物質は劣化しやすいため、作製から数週間（または場合によっては数日間）以上経過した寒天プレートは使用しないでください。プレーティングの前に、プレートを37℃程度で温め結露をなくすことにより、コンタミネーションとコロニーの混合を防止する必要があります。

プレーティングする大腸菌懸濁液の量は、スクリーニングのために十分な数の（かつ多過ぎない）はっきりした独立したコロニーを形成させる量でなければなりません。S.O.C. 培地で培養された大腸菌は、600 ～ 800 x g で 5 分間の遠心分離によりペレット化し、播種するためにより少量のS.O.C.培地で再懸濁します。100 mm プレートにプレーティングする場合、通常、細胞懸濁液を 100 ～ 200 μL にするのが適当です。コロニーが非常に少なくなることが予想される場合、細胞懸濁液をすべてプレーティングすることもあります。逆に、コロニー数が非常に多くなることが予想される場合は、プレーティングする前に細胞懸濁液を S.O.C. 培地で最大 1：100 程度に希釈することがあります。

A Pasteur pipette may be turned into a disposable homemade “hockey stick” or L-shaped spreader

図 6. パスツールピペットを手製ディスポーザブル「ホッケースティック」、または L 型スプレッダーにできる可能性。

寒天プレート上にコロニーが均等に散らばるようにする事も、解析の上で重要です。プレートを静かに回しながら大腸菌胞懸濁液を広げるために、滅菌済のホッケースティック型または L 字型のスプレッダーが一般的に使用されています（図 6、7A）大腸菌を広げる際に、寒天表面に傷をつけないでください。あるいは、大腸菌を広げるために、オートクレーブ滅菌したガラスビーズ（直径 4 mm程度）を使用する場合があります。この方法では、大腸菌懸濁液を塗布した後、10 ～ 20 個のビーズをプレート上に置き、プレートを穏やかに旋回させることにより、大腸菌懸濁液をビーズにより広げます（図 7B）懸濁液が乾燥する前に、大腸菌を速やかに広げる必要があります。広げた後、プレートを自然に乾燥させてから、上下をひっくり返し37℃で一晩インキュベートします。