プールされた細胞集団の切断効率を明らかにした後、単一細胞クローンを単離してさらなる検証およびバンキングを行います。96 ウェルプレートでの限界希釈クローニング(LDC)またはフローサイトメーターを使用したシングルセルソーティングにより、選択されたプールから単一細胞クローンを単離することができます。
フローサイトメーターを用いた 96 ウェルプレート内のシングルセルソーティング手順の例
シングルセルソーティングの機能を有するフローサイトメーターを用いて、ウェルあたり一つの細胞を96ウェルプレートフォーマットに入れることができます。単一細胞クローンを選別かつ増殖させた後、適切なアッセイを用いてクローン集団を分析し、特徴を明らかにします。以下は、293FT 細胞を用いたシングルセルソーティング手順の例です。
- 24 ウェルプレートの各ウェル中のトランスフェクションした 293FT 細胞を、PBS 500 μL で洗浄します。慎重に PBS を吸引し、廃棄する。
- TrypLE 細胞解離試薬 500 μL を細胞に添加し、37 °C で 2 ~ 5 分間インキュベートします。
- 完全増殖培地 500 μL を細胞に添加して、解離試薬を中和します。細胞を数回上下にピペット操作して細胞凝集体を分散させます。細胞が十分互いに離され、凝集していないことを確認してください。
- 細胞を 300 × g で 5 分間遠心分離してペレットにします。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを PBS 500 μL で 1 回洗浄してください。
- 1×106 個の細胞を FACS 緩衝液 1 mL に再懸濁し、ヨウ化プロピジウム(PI)を加え、最終濃度を 1 μg/mL とします。再懸濁した細胞を氷上に静置します。
- シングルセルソーティング機能を有するフローサイトメーターで細胞を分析する前に、適切なフィルターを用いて細胞を濾過してください。
- PI ネガティブ細胞を選別し、完全増殖培地 100 μL を含む 96 ウェルプレートに入れます。必要に応じて、完全増殖培地と一緒に濃度 1 倍の抗生物質を使用できます。
- プレートを37°C、5%CO2 インキュベーター内でインキュベートします。
- 倍率 4 倍の微鏡下で細胞の小凝集体を確認したら、すぐに単細胞コロニーのプレートをスキャンしてください。コロニーは、7 ~ 14 日後(細胞株の増殖速度によりますが、通常は第 1 週後に)に肉眼で見ることができるくらいの大きさでなければなりません。画像解析を行えば、コロニーが単一細胞由来であることを確認できます。
- 画像解析の後、プレートのインキュベーションをさらに 2 ~ 3 週間継続してクローン集団を増殖させ、さらに解析を行い、特徴を明らかにします。
編集されたクローンの特徴づけ
ジェノタイピング PCR、qPCR、次世代シーケンシング、ウェスタンブロッティングなどさまざまな分子生物学的方法によリ、純度および目的のジェノタイプ(ホモ接合アレルまたはヘテロ接合アレル)について単一細胞クローンを分析することができます。