一般的な CRISPR RNP トランスフェクションガイドライン

一般的な CRISPR／gRNA トランスフェクションガイドライン

• 哺乳類細胞での gRNA のトランスフェクション効率は、使用する細胞の種類およびトランスフェクション試薬によって変わります。トランスフェクション試薬の推奨事項については、表 1 を参照ください。
• 遺伝子編集については、gRNA 対 TrueCut Cas9 Protein v2のモル比が 1:1 の場合に最高の編集効率が得られます。iPSC や THP1 などのいくつかの細胞の種類の場合、24 ウェルフォーマットのウェルあたり最大 2 μg の TrueCut Cas9 Protein v2 と 400 ng の gRNA を使用しました。
• トランスフェクションのための最適な細胞密度は、細胞サイズおよび増殖特性によって変わります。通常、脂質によるトランスフェクションの場合はトランスフェクション当日に 30 ～ 70％ の細胞密度、Neon Transfection Systemを使用したエレクトロポレーションによるトランスフェクションの場合は 70 ～ 90％ の細胞密度を推奨します。
• 最大の遺伝子編集効率をもたらす TrueCut Cas9 Protein v2/gRNA の最適な細胞数と用量を決定した後、実験全体を通じ、所定の細胞の種類に対するこれらの条件を変更してはなりません。
  トランスフェクション効率に影響を及ぼす因子の概要については、thermofisher.com/cellculturebasics で入手できる Gibco 細胞培養基礎ハンドブック（Gibco Cell Culture Basic Handbook）の「トランスフェクションの基礎（Transfection Basics）」の章を参照ください。
• TrueGuide Positive Controls（ヒト AVVS1、CDK4、HPRT1 またはマウス Rosa26）および TrueGuide ネガティブコントロール gRNA（non-coding）を用いて、最高の細胞生存率で最適な遺伝子編集効率をもたらす gRNA 量およびトランスフェクション条件を決定します。TrueGuide Positive および Negative sgRNA ならびに crRNA Controls は、サーモフィッシャーサイエンティフィックから別売りされています。詳細については、thermofisher.com/trueguide を参照ください。
• 以下の手順に記載された細胞数および他の推奨事項は、弊社が試験した細胞の種類に基づいて開始点となるガイドラインです。複数ウェルの場合、ピペット操作の誤差を最小限に抑えるために、構成要素のマスターミックスを調製して適切な容量を各反応ウェルに分注します。反復測定ウェル用のマスターミックスを作製する場合は、あらゆるピペット操作の変動を許容するために、余裕を持った容量を調製してください。
   

推奨するデリバリーオプション

• 適切なトランスフェクション試薬を選択することは、トランスフェクションおよび遺伝子編集の効率にとって重要です。表 1 の推奨事項を参照ください。トランスフェクション試薬の詳細については、thermofisher.com/transfection を参照ください。
• 細胞株特異的な条件を表に示します。Lipofectamine CRISPRMAX トランスフェクション試薬を用いた細胞株特異的なトランスフェクション条件ならびに Neon System を用いた細胞株特異的な CRISPR RNP エレクトロポレーション条件。
  
   

表 1. TrueCut Cas9 Protein v2 のための推奨デリバリーオプション