One-Step RT-PCR System

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemに使用されている革新的な技術は、各プライマーペアに対するTmの最適化を必要としません。60℃のユニバーサルアニーリング温度はほとんどのプライマーペアに適しているため、最適化ステップを最小限に抑え、時間を節約し、反応セットアップにおけるミスを回避するのに役立ちます（図1）。

図1.2つのアニーリング条件におけるワンステップRT-PCRサイクリング。10 ngのUniversal Human Reference RNA（UHRR）から9つのターゲットを増幅しました；最初のバッチは60℃のユニバーサルアニーリング温度で増幅し（左）、 2番目のバッチはTm calculatorでPlatinum SuperFi DNA Polymerase用に計算したアニーリング温度で増幅しました（右）。分子量マーカーとしてThermo Scientific GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-useを使用しました。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは非常に高感度で、少量のターゲットを検出します（図2）。これにより、限られたRNAインプット量を使用してワンステップRT-PCR実験を行えます。

図2.少量のRNAインプットからのターゲット検出。SuperScript IV UniPrime One-step RT-PCR Systemによる、連続希釈した1 μg～0.01 pgのUHRRからの0.43 kbのフラグメントの増幅。分子量マーカーとしてThermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-useを使用しました。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは、RNA精製に使用される生体サンプルや試薬からの共精製成分などの一般的なRTおよびPCR阻害物質の影響に耐えられます。この優れた堅牢性により、RT-PCRシステムはRNAサンプルの純度に左右されにくくなるため、信頼性のある結果を得るのに役立ちます。他のワンステップRT-PCRキットの酵素は阻害剤の存在により阻害されました（図3）。

図3.阻害物質に対する耐性。次の物質を含有する反応混合物における、SuperScript IV One-step RT-PCR Systemまたは他のワンステップRT-PCRキットを使用した100 ngのUHRRからの1 kb RNAターゲットの検出（1）阻害剤なし、（2）キシラン（2.5 μg/μL）、（3）フミン酸（15 ng/μL）、（4）SDS（0.013%）、（5）Trozol（1.2%）、または（6）LiCl（2.5 μg/μL）。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは革新的な2段階ホットスタート活性化メカニズムを備えているため、室温での反応セットアップと、構築済み反応の長時間安定性を実現します。室温で長期保存しても高効率で特異的な増幅が観察されます。

• 3 kbまでのターゲットでは、反応物を24時間室温で放置した後に良好な増幅が観察されています（図4A）
• より長いターゲットの場合、反応物を最長4時間保存できます（図4B）

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemでは高処理能力の酵素を組み合わせているため、幅広いターゲット長の増幅が可能です（図5）。完全長cDNAはわずか10分で合成され、PCRステップの伸長に必要な時間はわずか30秒／kbであり、ワンステップRT-PCRキットの中でもっとも短いプロトコルの1つです。

図5.幅広いターゲット長にわたる汎用性。SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemと他のワンステップRT-PCRキットを使用した、0.2～9.4 kbのRNAフラグメントの検出。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは高い特異性、処理能力、およびユニバーサルアニーリングなどの特長を備えているため、大幅な最適化を行うことなくマルチプレックスでのRT-PCR反応を実施できます（図6）。

着色フォーマットでは、SuperScript IV RT Mixhaは赤色のトラッキング色素を含んでおり、UniPrime RT-PCRマスターミックスは青色のトラッキング色素を含んでいます。反応セットアップで2つの溶液を混合すると、最終の反応混合物は紫色になるため、反応セットアップを視覚的に追跡してピペッティングエラーを防止できます（図7）。

はい。SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは、ユニバーサルの60℃アニーリング温度と、Tm calculatorで計算されたアニーリング温度の両方で機能します。

長断片のワンステップRT-PCRでは優良試験所規範が重要です。これらには、高品質のテンプレート（純粋、調製したて、完全）や調製したてのプライマー溶液の使用が含まれます。検討すべき最適化ステップは、プロトコルで推奨されているように長い伸長時間とテンプレート量の増加などです。当社の分子生物学教室から逆転写をご覧になり、RT-PCR反応の最適化とセットアップについて詳細をご確認ください。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemを用いることで、他のワンステップRT-PCR製品を用いた場合よりも高温でcDNAを合成できます。GCリッチまたは構造的に複雑なRNAテンプレートの場合、cDNA合成インキュベーション温度を55～65℃まで上げることが推奨されます。

SuperScript IV One-Step RT-PCR SystemおよびSuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemで使用される2段階ホットスタートのメカニズムは、ワンステップRT-PCRワークフローにおいてRTおよびPCR酵素を確実に連続活性化します。常温では、SuperScript IV RTは感温性のRT-ブロッカーにより不活性な状態を維持します。約45℃での最初のホットスタート活性化段階でRT-ブロッカーが放出され、第1鎖cDNA合成が開始されます。2番目の活性化段階では、反応は98℃に加熱されDNAポリメラーゼを活性化し、同時にSuperScript IV RTを不活性化します。このメカニズムはRTとPCR酵素の活性を分離し、最高レベルのRT-PCR特異性と収率を実現します。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemは、平滑末端クローニングベクターの中に直接クローンを作ることができる平滑末端PCR産物を生成します。PCRの後に3′ dA-オーバーハングが付加されるとTAクローニングも可能です。PCR教育リソースをご覧になり、クローニングアプリケーション用のさまざまなPCR酵素の使用について詳細をご確認ください。

着色フォーマットのSuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemに含まれる赤色および青色のトラッキング色素は、E-Gelアガロースゲルでの電気泳動に干渉しません。E-Gelプレキャストアガロースゲルを使用して最適に分離するには、個別のE-Gelの推奨事項に従ってサンプルを2～30倍に希釈してください。

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemには、改変Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymeraseを含有する2X UniPrime RT-PCR Master Mixが含まれています。これは高い特異性と高い収量を実現し、配列の精度が必要なアプリケーションに最適です。このポリメラーゼは他の一般的なプルーフリーディング酵素とは異なり、dUTPに対応しています。

はい。SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR Systemを使用した反応セットアップは室温で実施できます。さらに、革新的な2段階ホットスタートメカニズムにより、構築済みの反応は室温において、3 kbまでのターゲットで最長24時間、>3 kbのターゲットでは最長4時間安定しています。