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タンパク質濃縮には、細胞内のタンパク質の配列、抗体エピトープ、翻訳後修飾(PTM)、または活性部位結合に基づいて細胞内タンパク質を分離するためのさまざまな技術があります。タンパク質の濃縮は、少量のタンパク質の分離やプロテオミクス解析のためにサンプルの複雑性を低減する上で欠くことができません。特定のタンパク質やタンパク質複合体の濃縮は、免疫沈降法などのイムノアフィニティ技術の使用やリン酸化タンパク質の濃縮などのPTMによる特定のアフィニティ結合を通じて、最も容易に行うことができます。弊社の画期的なThermo Scientific™ ActivX™ プローブと濃縮キットをご使用になると、キナーゼやGTPアーゼ、セリン加水分解酵素などのいくつかの酵素クラスを特異的に標的とすることができます。
Phosphoprotein Enrichment Kit | Streptavidin IP-MS Kit | Protein A/G IP-MS Kit | Kinase Enrichment Kit with ATP Probe | ActivX TAMRA-FP Serine Hydrolase Probe | |
Typical research goals | Discovery proteomics | Targeted proteomics | Targeted proteomics | Discovery proteomics | Discovery proteomics |
Target | Phosphorylated proteins | Single or homologous proteins | Single or homologous proteins | ATP binding sites | Active serine hydrolase enzymes |
Binding/labeling mechanism | Metal chelate affinity to phosphate groups | Biotinylated antibody affinity to target | Antibody affinity to target | Biotinylated ATP analog to active site lysine | TAMRA-labeled fluorophosphanate binds to active site serine |
Enrichment of target | Pre-digestion (protein) | Pre-digestion (protein) | Pre-digestion (protein) | Post digestion (peptide) | Post digestion (peptide) |
Enrichment format | IMAC | Immobilized Streptavidin | Immobilized Protein A/G | Immobilized Streptavidin | Immobilized anti-TAMRA mAb |
Base bead | Agarose | Magnetic | Magnetic | Agarose | Agarose |
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標的 | A431 | HEK293 | |||
---|---|---|---|---|---|
抗対ターゲット抗体 | ネガティブコントロール | 抗ターゲット抗体 | ネガティブコントロール | ||
配列 カバー率 | EGFR | 65% | 0% | 16% | 0% |
AKT1 | 36% | 2% | 68% | 6% | |
AKT2 | 50% | 0% | 82% | 0% | |
AKT3 | 8% | 0% | 62% | 0% | |
PTEN | 16% | 0% | 36% | 0% |
弊社のマススペクトロメトリーによる解析用の™ Pierce™ ストレプトアビジン磁気ビーズを使用した培少量から中程度の量のEGFR-AKT パスウェイターゲットの濃縮。EGFR-AKTパスウェイターゲットは、2種類の細胞株(A431 およびHEK293)からビオチン化抗体を用いて免疫沈降させ、Pierce ストレプトアビジン磁気ビーズで捕獲しました。IP溶出物はin-solutionで消化し、LC-MS/MSによる解析を行い、配列カバー率の評価ならびにイソ型に特異的なペプチドを同定しました。
酵素のターゲットキャプチャーと解析を目的としたウェスタンブロッティングとMSワークフロー概略図は、ActivXプローブを使用した、キナーゼ、GTPアーゼ、またはセリン加水分解酵素のプロファイリング、キャプチャーおよび検出を目的とした2つの並行するワークフローを示しています。阻害剤を使用して酵素をプレインキュベーションすると、プローブで標識したタンパク質のウェスタンブロッティング(セリン加水分解酵素に対してのみ蛍光SDS-PAGE)またはプローブで標識したペプチドの質量分析によって、阻害剤の特異性、結合アフィニティおよび力価を決定することができます。
標的 | A431 | HEK293 | |||
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抗対ターゲット抗体 | ネガティブコントロール | 抗ターゲット抗体 | ネガティブコントロール | ||
配列 カバー率 | EGFR | 65% | 0% | 16% | 0% |
AKT1 | 36% | 2% | 68% | 6% | |
AKT2 | 50% | 0% | 82% | 0% | |
AKT3 | 8% | 0% | 62% | 0% | |
PTEN | 16% | 0% | 36% | 0% |
弊社のマススペクトロメトリーによる解析用の™ Pierce™ ストレプトアビジン磁気ビーズを使用した培少量から中程度の量のEGFR-AKT パスウェイターゲットの濃縮。EGFR-AKTパスウェイターゲットは、2種類の細胞株(A431 およびHEK293)からビオチン化抗体を用いて免疫沈降させ、Pierce ストレプトアビジン磁気ビーズで捕獲しました。IP溶出物はin-solutionで消化し、LC-MS/MSによる解析を行い、配列カバー率の評価ならびにイソ型に特異的なペプチドを同定しました。
酵素のターゲットキャプチャーと解析を目的としたウェスタンブロッティングとMSワークフロー概略図は、ActivXプローブを使用した、キナーゼ、GTPアーゼ、またはセリン加水分解酵素のプロファイリング、キャプチャーおよび検出を目的とした2つの並行するワークフローを示しています。阻害剤を使用して酵素をプレインキュベーションすると、プローブで標識したタンパク質のウェスタンブロッティング(セリン加水分解酵素に対してのみ蛍光SDS-PAGE)またはプローブで標識したペプチドの質量分析によって、阻害剤の特異性、結合アフィニティおよび力価を決定することができます。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.