SARS-CoV-2のCollibri次世代シーケンシング用に最適化されたプロトコル

SARS-CoV-2ウイルスの次世代シーケンシング（NGS）により、世界の伝染をモニタリングし、ウイルスの進化や病理学に関する洞察を得ることができます。Illuminaシステム用Collibri DNAライブラリ調製キットが提供するSARS-CoV-2ゲノム解析は、高感度な変異検出を高いカバレッジを実現します。新たな変異株を迅速かつ高感度に分析することで、研究コミュニティはワクチンや治療開発に関する洞察を得ることができます。すべてのIllumina NGSシステムに対応しています。

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ターゲット濃縮プロトコル
PCR濃縮プロトコル

以下のワークフロー手順は、Illumina NGSシステム上のSARS-CoV-2などのコロナウイルスの研究に最適化されています。SuperScript IV VILO Master MixおよびThermo Scientific Second Strand cDNA Synthesis Kitを使用して、Santara Clinics Biobankからの同意を得て提供された気管支肺胞洗浄液（BAL）研究サンプルのライセートを精製し、逆転写しました。結果として得られたcDNAを、Illumina システム用Collibri ES DNAライブラリ調製キットを使用してNGSライブラリに変換し、濃縮しました。ライブラリをIllumina MiSeq ™ Systemで2 x 150 bpでシーケンスしました。

NGS coverage of SARS-CoV-2 samples from Collibri library prep kits Strong coverage from low sequencing of SARS-CoV-2 libraries using the Collibri library prep kits

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	サンプル1
サンプルタイプ	気管支肺胞洗浄液（BAL）
平均カバレッジ（x）	440.7
アライメントリード（カウント）	96,059
アライメントリード（%）	99.5
SNP コール（カウント）	10

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	サンプル2
サンプルタイプ	気管支肺胞洗浄液（BAL）
平均カバレッジ（x）612	612.1
アライメントリード（カウント）	134,431
アライメントリード（%）	99.6
SNPコール（カウント）	12

図1.強力なカバレッジと高感度なバリアント検出。検査でCOVID-19陽性を示した患者から2つの研究サンプルを得ました。そのカバレッジプロファイルは、サンプルあたり250,000回未満のリードから全ゲノムをカバーしていることを示しました。バリアント検出感度は、個々のサンプルの株同定に適しています。

ワークフロー

精製

DNA合成

ライブラリ作成

濃縮（推奨）

ライブラリ定量＆シーケンシング

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SARS-CoV-2のシーケンスに必要な材料

Illuminaシステム上のNGSによるSARS-CoV-2の研究に最適化されたプロトコルは、以下の表に示す試薬を使用します。

表1.最適化されたプロトコルの各ステップに対応する試薬は、サーモフィッシャーサイエンティフィックによって完全にサポートされています。

ステップ	キット	製品番号
1.トータルRNAの精製	MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit	A48310、A42352
2.RNAのcDNAへの逆転写	SuperScript IV VILO Master Mix および Second Strand cDNA Synthesis Kit	11756050、11756500 および A48570、A48571
3.NGSライブラリの調製	Illuminaシステム用Collibri ES DNAライブラリ調製キット	コンビナトリアルデュアルインデックス（CD）A38605024、A38607096 ユニークデュアルインデックス（UD）A38606024、A43605024、A43606024、A43607024、 A38607196
4.ライブラリの定量	Collibriライブラリの定量キットまたは Qubit fluorometerによるアッセイ	qPCR A38524100、A38524500 または Qubit Q32850、Q32853

手順

ステップ1：トータルRNAの精製

BALサンプルを溶解した後、トータルRNAを精製します。MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kitは、SARS-CoV-2検査のスループットを向上させるように最適化されています。

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ステップ2：RNAのcDNAへの逆転写

最良の結果を得るには、SuperScript VILO Master Mixを使用して第一鎖cDNAを合成し、Second Strand cDNA Synthesis Kitを使用して第二鎖cDNAを合成します。

SuperScript IV逆転写酵素ユーザーガイド
Second Strand cDNA Synthesis Kitユーザーガイド

ステップ3：NGSライブラリの調製

Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systemsの標準プロトコルには、以下の変更を推奨します。

ユーザーガイドをダウンロードする

表2.Collibri ES DNAライブラリ調製キットを使用したライブラリ作成に推奨されるプロトコル最適化。

ステップ	標準的な推奨事項			SARS-CoV-2サンプルに推奨される変更
1.DNAサンプルからEDTAを除去します	（必要な場合）			逆転写を完了した後、25 µLから始めます
	インプット：1～500 ng			インプット：50 ng
2.DNAを断片化し、dA-tailsを加えます	氷または冷却ラック上で、各DNAサンプルの断片化およびダテーリング反応を0.2 mLの滅菌薄壁PCRチューブに組み立てます。試薬を所定の順序で追加します。			氷または冷却ラック上で、各DNAサンプルの断片化およびダテーリング反応を0.2 mLの滅菌薄壁PCRチューブに組み立てます。試薬を所定の順序で追加します。
	コンポーネント	容量		コンポーネント	容量
	10 mm Tris-HCL、pH 7.5～8.5	40 µLまで		cDNA	10 µL
	二本鎖DNA（1 ng～500 ng）	X µL		10 mM Tris-HCI、pH 7.5～8.5	～31 µL
	10XフラグメンテーションおよびdA-tailing Buffer（青色）	5 µL		10XフラグメンテーションおよびdA-tailing Buffer（青色）	5 µL
	総容量（水色の混合物）	40 µL		総容量（水色混合物）	36 µL
	サンプルに5XフラグメンテーションおよびdA-tailing Enzyme Mixを加えます。			サンプルに5XフラグメンテーションおよびdA-tailing Enzyme Mixを加えます。
	コンポーネント	容量		コンポーネント	容量
	ステップ1からのバッファー-DNA混合物（水色混合物）	40 µL		ステップ1からのバッファー-DNA混合物（水色混合物）	36 µL
	5XフラグメンテーションおよびdA-tailing酵素ミックス（透明）	10 µL		5XフラグメンテーションおよびdA-tailing酵素ミックス（透明）	14 µL
	総容量（水色混合物）	50 µL		総容量（水色混合物）	50 µL
	目的のフラグメントサイズの最適化時間と最適化範囲			20分間37℃で断片化します。
	フラグメントサイズ	37℃での断片化時間
	フラグメントサイズ	遺伝子組み換え	最適化範囲
	150～300 bp	20分	20～30分
	300～500 bp	10分	10～20分
	500～700 bp	5分	5～10分
3.ポストライゲーションの両側サイズセレクションを実行します	ターゲットインサートサイズに合わせて両側サイズセレクションができます			カスタマイズされたクリーンアッププロトコル
4.PCRはライブラリを増幅します	PCRサイクルの数は、DNAの開始量（すなわち、インプットDNA）によって異なります。			12 PCRサイクルのライブラリを増幅します。

ステップ4：（推奨）SARS-CoV-2用ライブラリの濃縮

このオプションの濃縮ステップ（enrichment）は、コロナウイルスゲノムに焦点を当てたプロジェクトに推奨されます。このステップは、ウイルスゲノムとその宿主との相互作用を研究するプロジェクトでは省略できます。濃縮を実施する場合は、最大収量を確保するために追加の増幅が推奨されます（表4）。

表3.オプションの濃縮を実施するかどうかは、プロジェクトの目標によって決まります。

研究目標	推奨	利点
SARS-CoV-2ゲノム進化	ライブラリ調製後、SARS-CoV-2を濃縮します	SARS-CoV-2へのリードマッピングの割合の向上シーケンシングコストの削減
宿主病原体相互作用	濃縮なし。ライブラリの定量に進みます	宿主とSARS-CoV-2の両方の配列を保持

濃縮ライブラリを増幅します

Collibri 2Xライブラリ増幅マスターミックスを使用して、リッド温度が10℃に設定されたサーマルサイクラーで8回のPCRサイクルを実施します。PCRが完了したら、増幅後のクリーンアップに進みます（Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systemsのマニュアル27ページの「増幅DNAライブラリの精製」を参照）。

表4.濃縮NGSライブラリを増幅するための推奨PCR条件。

ステージ	サイクル数	温度	時間
酵素の活性化	1サイクル	98℃	30秒
変性	100 ngのインプットDNAで3～4サイクル 10 ngのインプットDNAを6～8サイクル 1 ngのインプットDNAに対して10～12サイクル	98℃	15秒
アニール		60℃	30秒
伸長		72℃	30秒
最終伸長	1サイクル	72℃	1分
ホールド	1サイクル	4℃	ホールド

ステップ5：ライブラリとシーケンスの定量

Collibri Library Quantification Kitを使用して、最終シーケンシングライブラリの濃度を測定します。変更は推奨されません。Illuminaが推奨するフローセルのロードに進みます。ライブラリは、すべてのIllumina NGSシステムと互換性があります。

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新しいSARS-CoV-2変異が継続的に出現しているため、確実かつ正確で迅速なシーケンシング戦略が必要です。以下のワークフロー手順は、SARS-CoV-2シーケンシング用に迅速にプロトコルを適応させたARTIC Networkが作成したアンプリコンシーケンシングプロトコルに従って、コロナウイルス研究用に最適化されています。

PCR濃縮を用いたSARS-CoV-2プロトコルの最適化されたCollibri次世代シーケンシングを使用して、合計1,001のSARS-CoV-2陽性臨床サンプルをシーケンスしました。図1で明らかなように、ターゲットのアンプリコンベースのシーケンシングアプローチは費用対効果が高いだけでなく、質の高い結果も提供します。ライブラリを、2 x 150 bpのペアエンドシーケンスにより、Illumina MiSeqシステムでシーケンスしました。これは、10% v/v Phixシーケンシングコントロールも含みます。BWA（bwa mem -t 32 -r 1.0 -k 19 -M -B 6 -v 1）を使用してアライメントを行いました。平均カバレッジ、すなわち参照したNCBI ASM985889v3ゲノムにアラインメントされる平均リード数は、QuantiMap BamQCにより計算しました。

Mean coverages across different sets of clinical samples

	収集1	収集2	収集3	収集4	収集5	収集6
サンプル数	93	192	192	192	140	192
平均アライメントリード（%）	97.3	70.2	85.9	85.6	91.0	86.4
平均アライメントリード（カウント）	134,623	26,335	91,653	60,920	121,623	91,653

図1.6つの各コレクションで異なるカバレッジ範囲を持つサンプルの割合。合計1,001のSARS-CoV-2陽性臨床サンプルをシーケンシングしました。Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systemsを使用したアンプリコンベースのワークフローソリューションにより、集団全体のウイルス調査および研究が可能であることが結果から示されています。