古典的トランスフェクション技術は、当初プラスミド DNA を細胞に導入するために開発されたもので、プラスミド DNA は依然としてトランスフェクションのもっともよく一般的なベクターとして残っています。組み換え遺伝子と調節因子を含む DNA プラスミドを細胞にトランスフェクションすることにより、遺伝子の機能と調節、遺伝子産物の突然変異分析と生化学的特性、細胞の健全性とライフサイクルに対する遺伝子発現の影響に関する研究、ならびに精製および下流アプリケーションのためのタンパク質の大規模生産が可能になります。

ベクターコンストラクトのトポロジー（直鎖状またはスーパーコイル状）およびサイズ、プラスミド DNA の品質ならびにプロモーターの選択は、プラスミド DNA トランスフェクション効率に影響する主な要因です。

ベクターに関する考慮事項

一過性トランスフェクションは高度なスーパーコイルDNA が用いられた場合、直鎖状 DNA を用いた場合に比べ効率的です。これはおそらく環状 DNA はエキソヌクレアーゼに対して脆弱ではないため、直鎖状 DNA フラグメントはこのような酵素によって急速に分解されるためだと考えられます（McLenachan et al, 2007; von Groll et al., 2006）。さらに、原子間力顕微鏡分析では、カチオン性脂質と環状および直鎖状DNA との複合体形成パターンが非常に異なることが示されています。つまり、環状 DNA ではコンパクトな球状または円柱状の凝縮物が観察されるのに対し、直鎖状プラスミドでは長い真珠のネックレスのような構造が観察されます。よりコンパクトな環状プラスミドのカチオン性脂質媒介トランスフェクションはエンドサイトーシスを通過する可能性がありますが、伸長した直鎖状 DNA 構造の導入経路はまったく異なり、効率が低いと考えられます（von Groll et al., 2006）。

安定トランスフェクションは、直鎖状 DNAを使用した場合により効率的ですが、これは宿主ゲノムへの最適な組み込みが生じるためです。フリーな末端を持つ直鎖状DNA は、より組み換えが誘導され、細胞による取り込み効率が低いものの、宿主染色体に組み込まれやすく安定した形質転換体を生じます。

カチオン性脂質媒介トランスフェクションにおける取り込み効率が同程度であっても、大きいプラスミドの核への導入は小さいプラスミド分子に比べ大きく損なわれます。この効果は、質量またはモル濃度が等しく、異なるサイズのコンストラクトを用いると観察され、プラスミドの核導入は細胞内移行速度によって制限され、小さいプラスミドは細胞防御を通してではなく細胞質内を素早く移動することで分解から回避することが示唆されます（Lukacs, et al., 2000; McLenachan et al., 2007）。

プラスミド DNA の品質

プラスミド DNA の純度および品質はトランスフェクションを成功させるためにきわめて重要です。フェノール、塩化ナトリウムおよびエンドトキシンを含まない最高純度のプラスミド DNA で最良の結果が得られます。夾雑物は細胞を死滅させ、塩は脂質複合体形成を妨げ、トランスフェクション効率を低下させます。エンドトキシンはリポ多糖としても知られ、プラスミド調製物の溶解ステップで放出され、多くの場合、プラスミド DNA と共精製されます。エンドトキシンの存在は初代細胞および他の敏感な細胞中のトランスフェクション効率を大幅に低下させます。トランスフェクションに最高品質の DNA が得られる PureLink HiPure Plasmid キット（Mini、Midi、Maxi、Mega、Giga）を用いてプラスミド DNA を分離することをお勧めします。

塩化セシウムバンド形成からも高度に精製された DNA が得られますが、この方法は労働集約的で時間がかかります。DNA 脂質複合体や DNA 溶液を過剰にボルテックスすることは、特に大きい分子である程度の剪断が生じ、それによりトランスフェクション効率が低下する場合があります。希釈した DNA 中の EDTA 濃度が 0.3 mM を超えないようにしてください。

遺伝子産物およびプロモーター

プロモーターの選択は、宿主細胞株、発現させるタンパク質および望ましい発現レベルに依存します。多くの研究者が強力な CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターを使用しているのは、これはこのプロモーターが非常に広範な細胞の種類でもっとも高い発現活性を提供するためです。哺乳類細胞で高いレベルのタンパク質発現をもたらすもう一つの強いプロモーターは、EF-1α（human elongation factor-1α）です。しかし、強力すぎるプロモーターを使用することは、潜在的に毒性のある遺伝子の発現を促進するため、プラスミド DNA の一過性トランスフェクションにおいて問題が生じることがあります。潜在的に毒性ののある遺伝子産物については、弱いプロモーターを使用することをお勧めします。

毒性遺伝子産物は、安定トランスフェクトされた細胞の選択にとっても問題です。抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は、そのような遺伝子の発現がトランスフェクトされた細胞の健全性に有害な場合、増殖優位性を失い、構成的プロモーターを持つ安定トランスフェクションされたクローンを獲得することが不可能になります。そのような場合には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現のタイミングを制御することができ、これにより安定トランスフェクタントの選択が可能になります。誘導性プロモーターは通常、機能するためには誘導分子（例：金属イオン、代謝産物、ホルモン）の存在が必要としますが、一部の誘導性プロモーターはそれとは反対の方法で機能します。すなわち、特定の分子の非存在下で遺伝子発現を誘導します。

細胞型特異的プロモーター、たとえば昆虫細胞発現のためのポリヘドリンプロモーターなども一般的です。文献検索は、使用する細胞株またはアプリケーションに最適なプロモーターを決定するための最適なツールです。

コントロール

使用するトランスフェクション法にかかわらず、細胞の健全性を確認するためにコントロールトランスフェクションを実施すること、レポーターアッセイが適切に機能しているか決定すること、インサートに関連する問題を明らかにすることが重要です。最適な細胞増殖条件を確認するためには、ネガティブコントロール（DNA なし、およびトランスフェクション試薬なし）を含めます。レポーターアッセイが適切に機能していることを確認するためには、ポジティブコントロール（確立されたトランスフェクション法での並行トランスフェクション）を含めます。インサート関連の問題があるかどうかを決定するためには、目的の遺伝子のないプラスミドでトランスフェクトします。

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.