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电荷异构体分析是生物治疗蛋白质的一项监管要求。这些大的异质分子在生产过程中历经多种酶促翻译后修饰,例如糖基化和赖氨酸切断。此外,在纯化和储存过程中可发生多种化学修饰,例如氧化或脱氨。离子交换电荷异构体分析是一种高分辨率技术,在分析这些异构体时非常有用。ICH Q6B等法规中规定使用蛋白质电荷异构体图谱分析法。
蛋白质电荷异构体可采用物理化学分离法 - 基于抗体或其他蛋白质的电荷特征进行分离。过去使用离子交换色谱盐梯度法进行蛋白质分离。盐梯度的关键挑战是需要为每个单独的目标蛋白质分子开发独特的梯度。此外,盐梯度法的重现性差,这意味着方法重现性和耐用性很差,并且方法开发非常耗时。
2009 年,Genentech 首次使用pH 梯度而不是盐梯度进行电荷异构体分离。pH 梯度法的优势包括该方法对任何单克隆抗体(mAb)均具有全球适用性,大大简化了方法开发过程。研究发现,等电点在 7-9 范围内的mAbs可采用阳离子交换柱在 pH 洗脱模式下得到很好地分离。此外,该方法更通用,可通过单个方法轻松分离大量抗体的不同电荷异构体,且 pH 梯度(30 分钟)分离较常规离子强度盐梯度(90 分钟)法用时较短。
全新色谱柱和仪器技术已呈现出进一步缩短运行时间的潜力:
较短的小粒径色谱柱与线性 pH 梯度结合,可将此分析带入真正的 UHPLC 应用领域。
该技术的难点在于如何制备真正的线性 pH 梯度。必须采用几种缓冲液来覆盖整个 pH浓度范围,以使每种缓冲液的缓冲能力相互匹配。色谱柱本身将用作对抗任何 pH 值变化的缓冲,因此需要仔细选择高分离度/低容量色谱柱。从下图可以清楚地看到使用缓冲液混合物制备线性 pH 梯度的困难,设定的线性梯度明显得到的是弯曲的梯度。这可通过使用市售的梯度缓冲液来克服,使用梯度缓冲液结合适合的色谱柱得到线性梯度。从逻辑上轻松实现方法优化,并实现各操作人员和各实验室之间的耐用性和一致性。
毛细管电泳(CE)等电聚焦技术也是用作电荷异构体分析的快速通用方法。虽然该方法有望用于分析,但它很容易出现平衡时间过长和操作人员结果不一致的情况。如今,HPLC 或 UHPLC pH 梯度法比 CE 法更快且更具重现性。HPLC 或 UHPLC 在所有生物制药实验室中也具有全球适用性并被分析人员熟知。此外,HPLC 或 UHPLC 可以对任意检测到的新异构体峰进行分离,以便通过进一步分析得到积极鉴定。
有关蛋白质电荷异构体分析产品和技术的更多信息,请访问我们的电荷异构体产品页面.
咨询爱尔兰都柏林国家生物工艺研究培训所(NIBRT)和赛默飞世尔科技的专家,了解完整蛋白质表征的最新分析进展。
在该项研究中,评估了盐和 pH 梯度法对狄迪诺塞麦单抗电荷异构体的分离效果。pH 缓冲液增强了电荷异构体的分离并提供了更快的筛查能力。
该研究表明,采用 pH 梯度强阳离子交换色谱法和ProPac SCX-10 色谱柱可为MAb电荷异构体提供出色的分离度。一部分异构体被鉴定为唾液酸化异构体。与常规 IEF 方法相比,该方法可更直接方便地进行蛋白质质量控制。
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