电荷异构体分析信息

采用离子交换色谱法分析蛋白质电荷异构体

蛋白质电荷异构体可采用物理化学分离法 - 基于抗体或其他蛋白质的电荷特征进行分离。过去使用离子交换色谱盐梯度法进行蛋白质分离。盐梯度的关键挑战是需要为每个单独的目标蛋白质分子开发独特的梯度。此外，盐梯度法的重现性差，这意味着方法重现性和耐用性很差，并且方法开发非常耗时。

2009 年，Genentech 首次使用pH 梯度而不是盐梯度进行电荷异构体分离。pH 梯度法的优势包括该方法对任何单克隆抗体（mAb）均具有全球适用性，大大简化了方法开发过程。研究发现，等电点在 7-9 范围内的mAbs可采用阳离子交换柱在 pH 洗脱模式下得到很好地分离。此外，该方法更通用，可通过单个方法轻松分离大量抗体的不同电荷异构体，且 pH 梯度（30 分钟）分离较常规离子强度盐梯度（90 分钟）法用时较短。

全新色谱柱和仪器技术已呈现出进一步缩短运行时间的潜力：
较短的小粒径色谱柱与线性 pH 梯度结合，可将此分析带入真正的 UHPLC 应用领域。

该技术的难点在于如何制备真正的线性 pH 梯度。必须采用几种缓冲液来覆盖整个 pH浓度范围，以使每种缓冲液的缓冲能力相互匹配。色谱柱本身将用作对抗任何 pH 值变化的缓冲，因此需要仔细选择高分离度/低容量色谱柱。从下图可以清楚地看到使用缓冲液混合物制备线性 pH 梯度的困难，设定的线性梯度明显得到的是弯曲的梯度。这可通过使用市售的梯度缓冲液来克服，使用梯度缓冲液结合适合的色谱柱得到线性梯度。从逻辑上轻松实现方法优化，并实现各操作人员和各实验室之间的耐用性和一致性。

毛细管电泳（CE）等电聚焦技术也是用作电荷异构体分析的快速通用方法。虽然该方法有望用于分析，但它很容易出现平衡时间过长和操作人员结果不一致的情况。如今，HPLC 或 UHPLC pH 梯度法比 CE 法更快且更具重现性。HPLC 或 UHPLC 在所有生物制药实验室中也具有全球适用性并被分析人员熟知。此外，HPLC 或 UHPLC 可以对任意检测到的新异构体峰进行分离，以便通过进一步分析得到积极鉴定。

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