NanoDrop微量分光光度計のアプリケーション

Acclaroリファレンスライブラリは現在、dsDNAサンプル中のタンパク質、フェノール、グアニジンHCl、およびRNAの検出に対応しています。またRNAサンプル中のタンパク質、フェノール、グアニジンイソチオシアン酸、およびdsDNAの検出にも対応しています。そして、タンパク質サンプル中のDNAも検出できます。今後、他の不純物がライブラリに追加される予定です。

不純物の同定は、研究者に2つの重要な情報を提供します。1つ目は、サンプル中に存在する可能性のある特定の不純物を同定することです。この情報は、抽出や精製が困難な際のトラブルシューティングや、サンプルをダウンストリーム実験で使用するかどうかの決定に役立ちます。2つ目は、分析物の補正濃度を提供することです。DNA濃度が重要なパラメータであるPCRなどのダウンストリーム反応を設定する際、補正濃度はダウンストリーム実験の成功を確保するのに役立ちます。

たとえば、ゲノムDNA調製におけるRNA混入は分子生物学ワークフローの一般的な問題です。従来の分光光度法では、共精製したRNAが存在すると、DNAの濃度が人為的に高く測定される場合があります。Acclaroソフトウエアで利用可能なフルスペクトルデータおよび多変量数学アルゴリズムを使用することで、研究者はDNAサンプル中のRNA混入を同定し、補正されたDNA濃度結果を確認できます。

MIQE guidelines—minimum information for publication of quantitative real-time PCR experimentsでは、qPCRを使用する文献にはインプットRNAの量と純度を報告することを要求しています。

精製済みタンパク質サンプルは、主にTrpおよびTyrアミノ酸の芳香族鎖による280 nmにおける直接吸光度を使用して、正確に測定できます。当社のソフトウエアに事前に設定されているアプリケーションであるタンパク質A280は迅速かつシンプルで、試薬や検量線が不要であり、サンプル消費量が非常に少ないため、もっとも一般的な定量法です。

純粋な各タンパク質は核酸とは異なり、そのアミノ酸配列に基づく固有のランベルト・ベール（Beer-Lambert）モル吸光係数を有しています。正確な結果を得るには、メニューから適切なサンプルタイプを選択するか、タンパク質のモル吸光係数を手動で入力します。NanoDrop OneおよびNanoDrop EightのProtein Editor機能を使用すると、特定のタンパク質のモル吸光係数を保存できるため、Sample Typeオプションをカスタマイズできます。

NanoDrop分光光度計は濃度に加えて、サンプル中の不純物に関する情報も提供します。Acclaroサンプルインテリジェンステクノロジー（NanoDrop One/One^CおよびNanoDrop Eight装置に搭載）は、数学的アルゴリズムを使用してタンパク質サンプル中の核酸を検出し、必要に応じて濃度結果を補正します。サンプルの純度も、A260/A280比を測定することで評価できます。この値が>1の場合、タンパク質サンプルの核酸混入を示している可能性があります。

タンパク質またはペプチドにTrpおよびTyr残基がないため、A280アプリケーションを使用して測定できない場合はどうすればよいでしょうか？タンパク質のペプチド骨格は190～220 nmの光を吸収するため、Tyr残基またはTrp残基を持たないペプチドは、205 nmにおける吸光度を使用して定量できます。タンパク質A205はNanoDropソフトウエアに事前に設定されているアプリケーションです。

多量のTrpおよびTyrを持つタンパク質は、Scopesメソッドオプションを選択することにより、A205アプリケーションを使用して定量することもできます。実際、A205法はA280タンパク質法と比べてタンパク質間のばらつきが少ないこと（A205吸光係数はアミノ酸組成に基づくものではないため）や、感度がより高い（205 nmにおけるタンパク質のモル吸光率が高いため）など、いくつかの利点があります。これまでは、技術的な限界によりこれらの測定は困難でしたが、NanoDropのサンプル保持技術と低い迷光性能により、少量のタンパク質のA205法による定量は簡素になりました。

A205法の限界は、一般的に使用されるタンパク質バッファーの多くが205 nmで吸光することです。この手法を使用する前に、205 nmにおける吸光度への影響についてタンパク質バッファーをチェックすることが推奨されます。

細胞抽出物やライセートなどの複合混合物中のタンパク質は、Bradford法、BCA法、Lowry法、またはPierce 660 nmアッセイなどのタンパク質比色アッセイを使用して測定するのが最適です。これらのアッセイは、紫外領域で吸光しA280測定値を増加させる細胞成分からの吸光度を避け、タンパク質に特異的な濃度を提供します。これらのアプリケーションやその他のアプリケーションは、特定のNanoDrop装置にあらかじめ構成されています。

標識された抗体や他の蛍光標識タンパク質および金属タンパク質は、タンパク質および標識濃度（2色素まで）を設定できる事前構成済みのタンパク質と標識ソフトウエアアプリケーションを使用して定量できます。このアプリケーションは、NanoDrop One/One^CおよびNanoDrop Eight分光光度計に事前構成されたアプリケーションとして利用できます。

例として、mRNAワクチンの生産はSARS-CoV-2との闘いにおいて非常に重要であり、他のウイルスに対しての展開が増えています。生産プロセスのいくつかのステップにおいて、サンプル濃度と純度の品質チェックは有用です。

• シーケンシング段階では、正確な結果を得るために、開始物質の品質と量の両方が重要です。
• プラスミド生産では、精製した血漿にゲノムDNAやその他の不純物がないか確認する必要があります。
• in vitro転写では、mRNA溶液をワクチンバイアルに充填する前に、精製mRNAの純度を確認する必要があります。

当社のオンデマンドWebセミナーを視聴して、どのようにしてこれらすべてのタスクにNanoDrop One/One^CおよびNanoDrop Eight分光光度計をすぐに配備できるかをご確認ください。また、FDA 21 CFR Part 11規制への準拠をサポートするのに利用できるソフトウエアにより、これらの装置はGMPラボにおけるmRNAワクチンワークフローにすぐに導入できます。

信頼性の高い当社のプレミアNanoDrop One/One^CおよびNanoDrop Eight分光光度計は、製薬やバイオテクノロジーなどの規制環境で使用できます。これらのモデルはわずか1～2 µLのDNA、RNA、およびタンパク質サンプルを数秒で定量および定性評価し、フルスペクトルデータを取得するため、サンプルがダウンストリームアプリケーションに適していることを確認できます。

さらに、オプションのThermo Scientific Security SuiteまたはThermo Scientific SciVaultソフトウエアは、お客様のラボが米国FDAのデータ規制に常に準拠するようにサポートします。これらのソフトウエアモジュールは、電子記録および署名に関する米国FDA連邦規制基準21章（21 CFR Part 11）への規制準拠を可能にします。

表は、ユーザーアカウントへのアクセス、監査証跡機能、電子署名、自動データバックアップなどの、NanoDrop One/One^C分光光度計用Security Suiteソフトウエアの一部の機能を示しています。NanoDrop Eight装置用のSciVaultソフトウエアは同様の機能を提供します。

製薬やその他の規制業界の製造業者が直面する変化し続ける規制環境は、コンプライアンスに関する混乱や疑問を引き起こす場合があります。規制要件を満たすように設計された装置システムは、製造業者の負担を軽減できます。どうすればよいでしょうか？製薬QA/QCラボにおけるコンプライアンスの維持に関する当社のWebセミナーをご覧になり、Thermo Scientific Nicolet Summit FTIR分光光度計（原材料および完成品のQA/QC用）およびNanoDrop One分光光度計（DNA、RNA、およびタンパク質の定量用）の2つの異なる装置プラットフォームがラボのプロセスにおいてコンプライアンスを確保するのにどのように役立つかをご確認ください。

細菌の培養増殖は、600 nm（OD₆₀₀）における光学密度を測定することでモニタリングできます。これは微生物学における中心的な手法ですが、これらの光学密度測定には真の化学吸光度はほとんど含まれていません。むしろ、光学密度は細菌懸濁液によって装置の検出器から散乱される光の量を表しています。

NanoDrop One/One^CおよびNanoDrop Eight分光光度計でOD600プログラム済みアプリケーションを使用して、OD₆₀₀を測定できます。ソフトウエアは、ランベルト・ベール（Beer-Lambert）の式とユーザーが入力した細胞数変換係数を使用して、OD₆₀₀値をミリリットルあたりの細胞数に自動的に変換します。

NanoDrop One^C装置では、OD₆₀₀値は台座とキュベットのオプションで異なることにご注意ください。変換係数を使用して、台座とキュベット測定を比較できます。

NanoDrop One^C装置では、キュベットのサンプルで経時的カイネティックを測定できます。190～850 nmの波長を最大3つまで指定して、最大5段階の中でユーザー定義の間隔で吸光度を連続的にモニタリングできます。キュベット測定では検出限界がより低く、オプションで37℃ヒーターおよびマイクロスターラーを使用できます。

カイネティクス実験をカスタムメソッドとして作成、編集、および保存できます。

上記のセクションで説明したように、NanoDrop分光光度計には核酸定量（dsDNA、ssDNA、RNAなど）およびタンパク質定量（A280、BCA、Bradford法など）用のメソッドが事前にロードされています。NanoDrop One/One^CまたはNanoDrop Eight分光光度計でカスタムメソッドを作成して、ニーズに合わせて紫外可視またはその他のユーザー定義の測定を実行することもできます。これにより、装置は従来の分光光度計としても機能できます。カスタムメソッドは190～850 nm間で最大40波長までモニタリングおよびレポートでき、直接タッチスクリーンで、またはPCコントロールソフトウエアからセットアップできます。カスタムメソッドは、装置を他のアプリケーションに使用できるという柔軟性を提供します。

• ナノ粒子、クロロフィル、ヘモグロビン、グルコース、およびタンパク質などのサンプルをBCAアッセイにより分析するには、事前定義済みカスタムメソッドをご使用ください。
• 特殊サンプルを分析するには新しいカスタムメソッドを作成して保存し、後の測定で使用できます。

例として、適切なモル吸光係数とピーク吸光度値を使用して、さまざまな形態のヘモグロビンを定量するのに分光光度計を使用できます。

• オキシヘモグロビンは結合酸素を含み、414 nm、541 nm、および576 nmで吸光ピークを示します。
• デオキシヘモグロビンは結合酸素を含まず、431 nmで吸光ピークを示します。
• メトヘモグロビンは、2価の鉄に鉄イオンを含むため酸素と結合できず、406 nmで吸光ピークを示します。

当社は、406、414、431、541、および576 nmにおけるヘモグロビンの吸光度を測定するために、NanoDrop One/One^C装置にカスタムメソッドを作成しました。これら5つの波長は、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、およびメトヘモグロビンを識別するために必要です。この結果グラフは、メトヘモグロビンの一般的な吸光度スペクトルを示しています。

ケモメトリクスは多変量数学モデルと統計手法を使用して、多くの成分の定量的濃度情報を同時に測定します。ケモメトリクスを使用して複雑な化学サンプル（混合物）からの紫外可視データを分析すると、スペクトルがオーバーラップする化学種の濃度を測定するためのパワフルなアプローチを得られます。 これまで、その多変量キャリブレーションモデルは精巧なために、このアプローチの使用はこの分野に深い知識を持つ人に限られていました。そのため、データ収集後の分析のためには、ほとんどのデータは経験豊富なケモメトリックの専門家に送信する必要がありました。

Thermo Scientific NanoDrop QCソフトウエアは、NanoDrop One^C微量測定プラットフォームにパワフルなケモメトリクス分析をもたらします。この組み合わせは石油化学分析、薬物純度、ポリマー製造、および食品着色料アプリケーションや、メモメトリック分析が必要なその他の多くのアプリケーションなど、幅広いアプリケーションに適した魅力的なソリューションです。

NanoDrop QCソフトウエアはケモメトリクス法の開発と導入を簡素化および合理化します。メソッドを開発する科学者は選択した化合物のスペクトルを収集し、Thermo Scientific TQ Analystソフトウエアにインポートしてメソッドを構築できます。メソッドは世界中のNanoDrop One^C紫外可視分光光度計に直接導入できるため、QC技術者は工場の現場で可否やその他の定量結果を得られます。

キュベットベースの紫外可視分光技術とPCベースのケモメトリクスソフトウエアは、染料、潤滑剤、および接着剤などの液体の品質分析において不可欠です。このような溶液のサンプル調製および分析には、高付加価値製品の発売に影響を与える時間のかかるプロセスが多くあります。当社の革新的で自動レンジ調整式台座型紫外可視分光光度計は、高濃度サンプルを希釈するなどの時間のかかるステップを排除し、ケモメトリクスメソッド開発のデータ分析を簡素化します。

当社のケモメトリクスアプリケーションノートでは、複雑な混合物中の個々のアゾ色素の濃度を測定するケモメトリクス法を作成および検証するためのステップ・バイ・ステップアプローチを説明しています。紫外可視スペクトルのオーバーラップが非常に大きい複数の成分を含有するサンプルの定量情報を取得するために、NanoDrop QCソフトウエアをどのように使用できるかについて示しています。

次世代の科学者を育み、彼らにインスピレーションを与えるためには、実際の装置にアクセスできることが重要です。ハンズオンの経験は科学へのアプローチを可能にし、科学原理をより記憶に残るものにするのに役立ちます。

特に紫外可視分光法は、生物学の授業においてタンパク質や核酸などの高分子を研究するための貴重なツールです。NanoDrop装置はシンプルかつお手頃価格であるため、学部や二次的な科学カリキュラムで使用するのに非常に適しています。NanoDrop分光光度計の使用経験は、ゲノミクス、免疫学、微生物細胞増殖、酵素カイネティクス、および生命の基本要素の構造と機能に関する学びをサポートします。

このWebセミナーでは、2人の高校教師がNanoDrop One分光光度計をどのように授業やワークショップに取り入れたかについて説明します。