ターゲット動物種の二次抗体

典型的な二次抗体は、特異性が高過ぎたり（例えば、一次抗体の宿主一種のみを認識する場合）、低過ぎたり（例えば、すべてのIgGとそのフラグメントを認識する場合）することがあります。このような制約は多くの場合、実験システムを注意深くデザインしたり、適切な二次抗体を選択することで解決できます。
以下の事項を考慮することは、二次抗体の選択を検討する際に有用です：

1. 一次抗体の宿主動物種の確定（マウス抗チューブリン、ウサギ抗CD4など）
2. 二次抗体に適切な宿主動物種の選択（ヤギ抗マウスIgG、ロバ抗ウサギIgG）
3. 二次抗体の交差反応性や特異性問題の考慮：
   • 吸収処理 ― 複数標識実験または内因性抗体を用いるサンプルの場合
   • 特異性 ― 一次抗体の妥当なフラグメント、クラス、またはペプチド鎖との結合
4. 検出法、精製法
   • 標識 ― 選択した検出法に適した、妥当な酵素、タグ、または蛍光物質との適切なコンジュゲート
   • プロテインA、プロテインG、またはプロテインLとの結合能 ― 選択した二次抗体が、上流または下流プロセスで使用される分子（すなわち、プロテインAコートマイクロプレート）と十分な親和性があることを確認
5. 二次抗体の供給要件の考慮：供給状態 ― キャリアタンパク質（ゼラチン、アルブミンなど）、安定剤（ショ糖など）、または微生物阻害剤を含む、PBSもしくはトリスバッファーに懸濁された無菌液または凍結乾燥

最も一般的な二次抗体は、ターゲット動物種由来の免疫グロブリン貯留集団に対して生成されるものです。例えば、ヤギを精製マウスIgGで免役すると抗マウスIgG抗体が生成されます。生成された抗体は、マウスIgGの全クラス、重鎖と軽鎖（H&L）、フラグメント、および同一保存領域を共有するその他すべての分子（例えば、IgMはIgGと同じκ軽鎖を共有する）に結合することができます。一方、ヤギをマウスIgG1抗体のみで免疫すると、マウスIgG1抗体および同一保存領域を共有する分子に特異的な抗体だけが生成されます。

免疫グロブリンドメイン構造の多くが高度に保存されているため、クラス特異的な二次抗体については、アフィニティー精製と吸収処理によって他の免疫グロブリンとの交差反応性を最小化する必要があります。前述の例で言えば、固定化したマウスIgG1抗体を用いたアフィニティー精製により、マウスIgG1に結合するすべてのヤギ抗体が精製されます。精製された抗マウス IgG1抗体を、マウスIgG2a、IgG2b、IgG3、IgMなどを含むクロマトグラフィーカラムに通すことでさらに精製し、IgG1アイソタイプ以外と交差反応する抗体をすべて除去します。

さらに、二次抗体については、宿主の免疫に用いた以外の動物種から採取した固定化血清タンパク質を含むカラムに通すことで、より一層の精製が行われる場合があります。このような吸収処理法（「Cross-Adsorbed」と呼ばれる）は、複数種由来の一次抗体や、免疫グロブリンなどの血清タンパク質が存在する可能性があるサンプルを用いた実験に推奨される、付加的な精製ステップです。