緒言

αβ-T細胞受容体（TCR複合体）を介したT細胞の活性化は、in vitroでの増殖に必要です。モノクローナル抗CD3抗体および抗CD28抗体でT細胞を処理すると、TCRに結合することで共刺激シグナルが生じ抗原誘導が活性化されます。以下に説明するように、増殖因子の有無にかかわらず、機能的抗体を使用することは、T細胞集団を増殖させるためのより経済的な方法です。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activationは、ヒトT細胞の活性化および増殖にも使用できます。Dynabeads T cell activation and expansion beadsは、強力な刺激による均一な細胞増殖が可能で、ゲノム編集による遺伝子治療に有用です。PMAまたはコンカナバリンAは、細胞内転写因子のレベルを増加させるためのより短い時間のインキュベーションと、フローサイトメトリーおよびイムノアッセイのためのサイトカイン産生に使用できます。


材料

  1. 滅菌済細胞培養用6ウェルプレート（例：Nunc細胞培養用6ウェルプレート、カタログ番号140675）
  2. 15mLコニカルチューブ（例：Nunc 15 mLコニカル滅菌済遠心チューブ、カタログ番号339650）
  3. 抗CD3（例：抗ヒトCD3（OKT3）、機能グレード、カタログ番号16-0037-81または抗マウスCD3モノクローナル抗体（17A2）、機能グレード、カタログ番号16-0032-82）
  4. 抗CD28抗体（例：抗ヒトCD28モノクローナル抗体（CD28.2）、ファンクショナルグレード、カタログ番号16-0289-81またはCD28モノクローナル抗体（37.51）、ファンクショナルグレード、カタログ番号16-0281-82）
  5. RPMI1640培地（例：BenchStable RPMI 1640培地、カタログ番号A4192301またはOpTmizer T細胞増殖、カタログ番号A3705001）
  6. ウシ胎児血清（例：Gibcoウシ胎児血清、カタログ番号26140087、またはウシ胎児血清One Shot format、カタログ番号A3160401）
  7. L-グルタミン（例：200 mM L-グルタミン、カタログ番号25030149）
  8. オプション：ペニシリン-ストレプトマイシン（例：Gibcoペニシリン-ストレプトマイシン、カタログ番号15140148）
  9. リン酸緩衝生理食塩水（例：Gibco PBS（10倍）、pH 7.4、カタログ番号70011044）
  10. 細胞スクレーパー（例：Nunc細胞スクレーパー、カタログ番号179693）


手順

  1. 6ウェル培養プレートを準備しラベルします。上部3ウェル：活性化T細胞および下部3ウェル：非活性化T細胞
  1. 滅菌済PBSで抗CD3抗体を1 μg/mLに希釈して、活性化T細胞のウェルを抗CD3抗体でコーティングしてください。希釈した抗体を2 mL／ウェルで3つのウェルに添加します。プレートを5% CO2、37℃で2時間インキュベートします。
  1. RPMI 1640培地にウシ胎児血清を添加して、最終濃度10%および2 mM L-グルタミン（現在GlutaMAXが添加されていない培地を使用している場合）になるように完全RPMI 1640培地を調製します。培地を37℃に加温します。オプション：培地に1%ペニシリン-ストレプトマイシン（5,000ユニット／mL）を添加します。
  1. 無菌条件下で無菌技術を用いて、全血またはリンパ系組織からPBMCを分離します（それぞれ、以下の補足プロトコルAまたはBを参照）。
  1. 完全RPMI 1640培地で3 x 106個／mLの細胞濃度になるよう再懸濁します。
  1. 細胞溶液を2つのコニカルチューブに均等に分けます。一方のチューブに活性化、もう一方のチューブに非活性化のラベル表示をします。
  1. 活性化チューブに5 μg/mLの抗CD28を加え、培養フード内（室温）に置いておきます。
  1. 2時間後にインキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。抗CD3溶液を吸引し、廃棄します。プレートを洗浄しないでください。
  1. 活性化細胞溶液（ステップ7から）を6ウェルプレートの抗CD3処理ウェル（活性化T細胞）に均等に分注します（ウェルあたり2～3 mL）。
  1. 非活性化細胞溶液をコニカルチューブから6ウェルプレートの未処理ウェル（非活性化T細胞）に移します（ウェルあたり2～3 mL）。
  1. 培養プレートを5% CO2インキュベーター内で37℃で1～3日間インキュベートします。Day 1までに、細胞は転写因子とサイトカインを産生します。ほとんどのT細胞は分裂に最大3日かかります。これらの細胞は凝集しますが、プレートに付着しません。
  1. 細胞スクレーパーで細胞を回収します。

プロトコルのコツ：

抗CD3と抗CD28抗体の最適な濃度範囲は経験的に決定する必要があります。抗CD3（マウスおよびヒト）の場合、最適な濃度範囲は1～3 μg/mLであり、抗CD28（マウスおよびヒト）の場合、最適な濃度範囲は3～5 μg/mLです。

プロトコルのコツ：

IL-2は細胞傷害性T細胞の増殖と分化を刺激します。抗CD28の代わりに100 ngの IL-2組み換えタンパク質（カタログ番号PHC0026）を添加すれば、この集団が増殖しやすくなります。

プロトコルのコツ：

時間を節約するために、抗CD3はステップ3で最終濃度1 μg/mLで培地に直接添加できます。

プロトコルのコツ：

このプロトコルは、 T75フラスコを使用することにより、より多くの細胞量に合わせて規模を調整できます。


補足プロトコルA：全血からのPBMCの分離

材料

  1. リン酸緩衝生理食塩水（例：Gibco PBS（10倍）、pH 7.4、カタログ番号70011044）
  2. 15 mLまたは50 mLコニカルチューブ（例：Nunc 15 mLコニカル滅菌済遠心チューブ、カタログ番号339650）
  3. Ficoll-Paque®密度勾配分離培地
  4. フローサイトメトリー染色バッファー（例：eBioscienceフローサイトメトリー染色バッファー、カタログ番号00-4222-26）

手順

  1. コニカルチューブで血液サンプルをPBSで少なくとも1：1に希釈します。
  1. 元のサンプル量と等量のFicoll-Paque®培地を希釈サンプルの下に置きます。
  1. ブレーキをオフにした状態で、室温で20分間、400 x gで遠心分離します。
  1. PBSとFicoll-Paque®培地層の界面にあるPBMCを新しいチューブに回収します。
  1. チューブをPBSで満たし、細胞を洗浄します。
  1. 細胞を2～8℃で4～5分間、300～400 x gで遠心分離します。上清を廃棄します。
  1. 細胞ペレットを適量のフローサイトメトリー染色バッファーまたは任意のバッファーに再懸濁し、細胞数と生存率の分析を行います。
  1. ステップ6のように細胞を遠心分離し、適量の完全RPMI 1640で、最終濃度が3 x 106個／mLになるよう細胞を再懸濁します。

注：

細胞を培養するので、無菌的にすべてのステップを実施し、また、アジドを含まないバッファーを使用します。

プロトコルのコツ：

自動セルカウンターを使用すれば、採取したばかりの末梢血単核細胞からの細胞の健康状態と濃度の評価の精度が大幅に向上します。 Countess II FL自動細胞カウンターを使用してPBMCを計数する方法に関する 詳細なプロトコルを参照してください。


補足プロトコルB：リンパ系組織からの免疫細胞の分離

材料

  1. 60 x 15 mmの細胞培養皿（例：Nunc細胞培養ペトリ皿、カタログ番号150340）
  2. プラスチック製の3 mLシリンジまたはつや消しされたガラス製顕微鏡スライド2枚
  3. セルストレーナー（ナイロンメッシュ）
  4. 15 mLまたは50 mLコニカルチューブ（例：Nunc 15 mLコニカル滅菌済遠心チューブ、カタログ番号339650）
  5. フローサイトメトリー染色バッファー（例：eBioscienceフローサイトメトリー染色バッファー、カタログ番号00-4222-26）

手順

  1. 組織（脾臓、胸腺、リンパ節）を10 mLのフローサイトメトリー染色バッファーまたは任意のバッファーを入れた細胞培養皿に採取します。3 mLシリンジのプランジャーで押し出し、単細胞懸濁液に調製します。あるいは、10 mLのフローサイトメトリー染色バッファーを用いて、2枚の顕微鏡スライドのすりガラスの端に組織を挟みつぶしてください。
  1. 15 mLコニカルチューブの上にセルストレーナーを置きます。細胞培養皿から細胞をセルストレーナーに通して、凝集塊やデブリを除去します。
  1. 細胞懸濁液を2～8℃で4～5分間、300～400 x gで遠心分離します。上清を廃棄します。
  1. 細胞ペレットを適量のフローサイトメトリー染色バッファーまたは任意のバッファーに再懸濁し、細胞数と生存率の分析を行います。
  1. ステップ3のように細胞を遠心分離し、適量の完全RPMI 1640培地で、最終濃度が3 x 106個／mLになるように細胞を再懸濁します。

注：

リンパ系組織から単細胞懸濁液への調製は、一般的に機械的な分散で十分です。

注：

細胞を培養するので、無菌的にすべてのステップを実施し、また、アジドを含まないバッファーを使用します。

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.