Attune Flow Cytometerのサンプルデータ

• 画像データによるダブレット識別
• 凝集したCEN細胞
• 細胞培養のQC

堅牢な手動の一重項シングレットゲーティングでもエラーは発生しやすく、ほぼすべてのフローサイトメトリーアッセイにおいて、主観的な判断ポイントです。イメージングはゲートの確認と調整に使用でき、目的の単一細胞だけを含めることが可能です。

ここでは、経験豊富なユーザーがシングレットを確実にゲーティングしました。CytPix装置の画像由来のパラメーターを使用してシングレットゲート（Manual Singlets）を評価すると、このゲートは>4%の凝集体を含むことがわかります。

もっとも重要なことはおそらく、これらのイベントには明らかに異なる表現型の細胞が含まれており、二重陽性イベント（特に希少集団）に関して誤った結論を導く可能性があることです。

Aged whole human blood (AllCells) lysed with ammonium chloride lysis buffer. Image processing was done using the Cells_Half_Resolution_v22 model. Statistics shown are % gated.

イメージングは、ゲートの確認と調整に使用でき、目的の単一細胞だけを含めることが可能です。ニワトリ赤血球核（CEN）細胞は、粘性が高いことで知られており、ダブレットや他の凝集体に結合しやすい傾向があります。研究者は、ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイを用いて、これらの凝集体を同定することがよくあります。この場合、連続するピークがイベントにおける細胞数に対応します。しかし、イメージングにより、次のレベルの凝集体が、先行するピークの右肩に重なって現れ始めていたことが明らかになりました。たとえば、ピークI（シングレットだけを含むと想定）の右肩に、多くのダブレットが含まれていたとします。ゲートを締めることで、不要なダブレットが正常に除去され、次のゲートに適切にシフトされました。

Accurate gating for sticky CEN cells. CEN cells were stained with PI per manufacturer directions (BD) and acquired on the Attune CytPix Flow Cytometer at 100 µL/minute. On a PI histogram, gates were originally drawn to include the shoulders on both sides of each peak (CEN gating strategy 1, top center), expecting that gate I would contain singlets, gate II doublets, and so on. However, images of doublets (left) were captured within gate I. Moving gate boundaries to the left to exclude the right shoulders for each peak (CEN gating strategy 2, right) effectively classified both single cells and aggregates within the correct gate.

品質管理（QC）ワークフローに迅速なイメージングを追加することで、プロセスの初期段階で細胞培養の問題を検出して特定できます。あるラボでは、Ramos（リンパ腫）細胞培養の日常的な継代チェックにより、コンフルエントであるにもかかわらず、細胞数と生存率の低下が確認されました。追加調査で著しい微生物汚染が明らかになりましたが、それはいつどこで始まったのでしょうか？

この細胞株はAttune CytPix Flow Cytometerで解析していたため、研究者が画像をさかのぼり、少なくとも5日前の微生物感染が記録できていました。当時、初期の兆候は細胞片として片づけられていましたが、振り返って評価すると、培養中に問題のある細胞と特性を共有していたことが明らかになりました。感染を追跡することは、そのラボにおける、実験に不可欠な細胞株のスクリーニングおよび保護に対して追加手順を確立することに役立ちました。

Contamination of a Ramos cell culture. Ramos (lymphoma) cells in culture showed reduced cell counts and survival during a routine passage quality check, despite appearing confluent. Further evaluation showed microbial contamination, confirmed by imaging and backgating on the Attune CytPix Flow Cytometer (A,B). Early signs of this contamination (C) had initially been dismissed as debris.

• 腫瘍免疫学におけるレアイベントの解析
• CAR T免疫療法

Attune Flow Cytometerを使用すると、サンプルを濃縮することなく、大容量サンプルをわずかな時間で簡単に解析できるため、全細胞の1%未満の細胞集団を信頼性の高い精度で検出できます（下記参照）。

Detection of rare ILC2 population in PBMCs
(A) Labeling of 1 x 10⁶ PBMCs resuspended in 100 μL PBS (+10% FBS). The antibodies used were a lineage cocktail containing CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD56, and CD235a conjugated to Invitrogen FITC, CD123-FITC, and CRTH2-Alexa Fluor 647 conjugates. The ILC2 cells are then defined as the lineage (BL1)-negative, CRTh2 (RL1)-positive populations. (B) CRTH2 cells expressing the chemoattractant receptor–homologous molecule expressed on Th2 cells. CRTH2 is a seven-transmembrane protein coupled with heterotrimeric G proteins. CRTH2 is the prostaglandin D2 receptor and is expressed by Th2 cells, eosinophils, and basophils. CD294 prevents the apoptosis of Th2 cells and mediates the chemotaxis of CRTH2-expressing cells to the sites of allergic inflammation, such as the asthmatic lung. (C) The ILC2 cells are defined as lineage-negative and CRTH2-positive. In this example, the ILC2 population is 0.016% of the parent gate. Data courtesy David Cousins, University of Leicester.

イメージングによって、免疫細胞間の相互作用を含む細胞機能の証拠を示すことが可能です。改変CAR T免疫療法細胞をRamos（リンパ腫）細胞と共インキュベートし、Attune CytPix Flow Cytometerで染色、取得、および撮影しました。第2象限の画像（両方の染色で陽性、単一のイベントとして取得）は、CAR T細胞が明らかにRamos細胞を標的にしていることを示しており、免疫細胞の効果が明確に証明されています。

Visualization of CAR T cells targeting lymphoma cells. CAR T cell and Ramos cells were labeled with CellTrace Far Red and CellTrace Violet respectively and incubated at a 1:1 ratio for 1 hour at 37°C. Unfiltered samples were acquired on the Attune CytPix Flow Cytometer at 200 µL/minute, >8 x 10⁵ cells/mL. Images of quadrants Q1 (top left), Q4 (bottom right), and Q3 (bottom left) show individual Ramos cells, CAR T cells, and debris, respectively. Images from quadrant Q2 (positive for both stains, top right) reveal both cell types fused together, acquired as a single event as the CAR T cells engulf the Ramos cells.

当社は以前、CAR-T細胞とRamos細胞の相互作用をイメージングすることのパワーを実証しました。詳細を得るために、もっとも関心のある集団であるダブルポジティブイベントについて見てみましょう。拡張された画像派生パラメーター（真円度vs強度の歪み）を使用することで、この集団をさらに明確化し、データの堅牢性を向上できます。ここでは、画像派生パラメーターを使用することにより、細胞間相互作用と同時イベントをより正確に区別できることが示されています。

Visualization of CAR-T cells targeting lymphoma cells. CAR-T and Ramos cells were labeled with CellTrace Far Red and Violet respectively and incubated at a 1:1 ratio for 1 hour at 37°C. Unfiltered samples were acquired on the Attune CytPix flow cytometer at 200 µL/minute, >8 x 10⁵ cells/mL. Images of quadrants Q1 (top left), Q3 (bottom right), and Q4 (bottom left) show individual Ramos cells, CAR T cells, and debris, respectively. Images from quadrant Q2 (positive for both stains, top right) reveal both cell types fused together, acquired as a single event as the CAR-T cells engulf the Ramos cells. Percentages are % gated.

In the cell image galleries, annotated events are outlined in black with yellow dots indicating center positioning. Image processing was done using the Cells Half Resolution model by analyzing circularity versus skewness of intensity. This allows us to differentiate between attached cell interactions (between CAR-T and Ramos cells) and detached where cells are in the same field of view but not showing cell-to-cell interactions.

Colorectal cancer cells were spiked into healthy human PBMCs at a rate of 1,000 cells per sample. All samples prepared by Amsterdam UMC. Statistics shown are cell counts. Image processing was done using the Cells_Half_Resolution_v22 model.

Attune flow cytometers offer a fast, easy, and accurate platform to measure protein and gene expression. This includes viral proteins expressed in infected host cells.

In the data below, researchers were able to measure SARS-CoV-2 nucleoprotein expression in cultured human cells before and after exposure to SARS-CoV-2, the novel coronavirus that causes COVID-19 disease.

 SARS-CoV-2 Nucleoprotein staining of infected 293T-ACE2 cells. (A) Uninfected cells and (B) SARS-CoV-2 infected 293T-ACE2 cells after 36 hours at an MOI of 0.1. Cells were prepared using standard protocols and stained using a SARS coronavirus nucleoprotein monoclonal antibody (clone 1C7C7) and anti-mouse secondary antibody conjugated to PE (Cat. No. P852). Data was collected using an Attune NxT flow cytometer equipped with autosampler. Analysis was performed in FCS Express 7.

ヒト多能性幹細胞（hPSC）を分化した細胞表現型に誘導できることは、個別化医療や再生医療に大きな可能性をもたらします。Attune Flow Cytometerは、幹細胞や心筋細胞のような脆弱で大型の細胞での使用に最適です（下記参照）。シリンジ駆動のシステムと大きなフローセルは目詰まりを防ぐように設計されているため、貴重なサンプルの損失を防止し、目詰まりの可能性を低減します。

Flow cytometry analysis of transcription factors during cardiomyocyte differentiation. Two-parameter plots representing staining profiles for Oct4 and Nkx2.5 in H9 hPSC cells during cardiomyocyte differentiation. All plots were gated on singlet cells. (A) At day 1, nearly all cells are Oct4⁺ and Nkx2.5^–, consistent with a pluripotent state. (B–J) During the time course of differentiation, with data shown for each day of differentiation, cells lose Oct4 expression and begin to express the cardiac marker Nkx2.5. The precedence-density plot display is used, with the red-colored population representing Nkx2.5⁺ cells, and the green-colored population representing Oct4⁺ cells.

• 微生物学
• イメージングを利用した微生物学の解析

大腸菌細胞を長時間インキュベートすると、単細胞に類似した短いCFUと、不完全な分裂環を持つ伸長構造の2種類のコロニー形成ユニット（CFU）に成長し、各細胞のおおよその長さで不完全な収縮を示します。従来のシングレットゲート（SSC-A vs SSC-H）でも、蛍光ゲート（SSC vs 核染色）でも、これらの集団を十分に分離しません。しかし、Attune CytPixイメージング強化型のフローサイトメーターを使用すると、画像を表示およびグループ化し、その形態特性に基づいてCFUタイプをゲートできます。

Discrimination of two E. coli CFU types. E. coli cells were incubated overnight at 37ºC followed by 3 days at 4ºC. Samples were acquired on the Attune CytPix Flow Cytometer at 100 µL/minute. From the images, two types of CFUs were identified: (A) short colonies resembling single cells and (B) elongated structures with incomplete fission rings. Representative images from each population are shown. Backgating on the selected images demonstrated that the two populations are distinct on FSC vs SSC dot plots (orange dots, left).

フローサイトメトリーは、シンプル、迅速、かつ正確で信頼性の高い方法を提供するため、植物ホモジネート中のC値（核DNA含有量）を確認するための最適な選択肢となり、植物生物学においてフローサイトメトリーの使用が急速に増加しました。Attune Flow Cytometerは、DNA含有量の評価に最適です。もっともお手頃価格のシングルレーザーシステムなど、どの標準構成でも使用できます。

Data were collected from plant nuclei prepared from A. thaliana Col-1 leaf tissue and labeled with FxCycle PI/RNase Staining Solution using the 532 nm laser. (A) Biparametric density plot of side scatter vs. FxCycle PI/RNase fluorescence, with a scatter gate surrounding the fluorescent nuclei. (B) Biparametric density plot of FxCycle PI/RNase fluorescence to gate on singlet nuclei. (C) Logarithmic histogram of FxCycle PI/RNase fluorescence of nuclei-gated population, showing multiple peaks corresponding to 2C, 4C, 8C, and 16C nuclei.
 

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2種類の異なるタイプの大腸菌コロニー形成ユニット（CFU）を示す微生物学データについては、上記のイメージングを利用したフローサイトメトリーのセクションの"イメージングを利用した微生物学"を参照してください。

• フローサイトメトリーによるマルチプレックスCRISPR編集の解析
• CRISPR編集細胞の解析

Screening for protein knockdown efficiency at multiple loci. Human peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) were cultured, and T cells subsequently activated using Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 kit. Cells were then edited using Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA, TrueCut Cas9 Protein v2 and the Invitrogen Neon Transfection System. gRNAs targeting the human T cell receptor, Beta-2-Microglobulin and CD47 genes were designed using the Invitrogen TrueDesign Genome Editor tool. Cells were analyzed for editing efficiency 72 hours post transfection by flow cytometry analysis, as measured by functional protein knockdown at each locus. Samples were run on the Attune NxT Flow Cytometer and CytKick Autosampler. The overlay plots above were generated by Attune Cytometric Software. Each histogram is overlayed with the non-neon control. Monoclonal antibodies used were TCR alpha/beta (IP26) PE (eBioscience), Beta-2 Microglobulin (B2M-01) FITC, and CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780, (eBioscience).

Attuneフローサイトメーターを使用して、CRISPR編集細胞の編集効率を迅速かつ効果的に解析できます。フローサイトメトリーによる解析には、編集効率を解析する他の方法と比較して、いくつかの利点があります。

• 機能タンパク質ノックダウンの効率データを提供。
• 単一細胞のマルチパラメーターノックダウン効率解析、すなわち複数の遺伝子座で同時に編集される細胞の割合を提供。
• 増殖や生存率などの他のパラメーターを追加でき、混合細胞集団中の異なる細胞タイプの編集効率を判別。

Flow cytometry overlay plots of protein knockdown in human PBMCs at the TCR alpha/beta, B2M and PD-1 loci. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured, and T cells subsequently activated using Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 kit. Cells were then edited using Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA, TrueCut Cas9 Protein v2 and the Invitrogen Neon Transfection System. gRNAs targeting the human T cell receptor, Beta-2-Microglobulin and CD47 genes were designed using the Invitrogen TrueDesign Genome Editor tool. Cells were analyzed for editing efficiency 72 hours post transfection by flow cytometry, next-gen sequencing, Sanger sequencing analysis and the genomic detection cleavage assay. The Attune NxT software was used for all figures and data analysis. Each histogram is overlayed with the non-neon treated control and each figure is data collected from a single well. Monoclonal antibodies used were TCR alpha/beta (IP26) PE (eBioscience), Beta-2 Microglobulin (B2M-01) FITC, and CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780, (eBioscience).

Attune Flow Cytometerを使用したCRISPR編集細胞の解析は、編集効率を正確かつ迅速に定量化し、複数のCRISPR gRNAをマルチプレックスする場合に特に有用です。シングルセル解析、機能的なノックアウトの有効性、迅速で実用的なデータ、最小限のサンプル処理時間などは、遺伝子編集解析にフローサイトメトリーを使用する利点の一部です。

今日、蛍光タンパク質は、遺伝子発現や、生細胞内のタンパク質の局在、移動、および輸送の研究に広く使用されています。より高度な手法には、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術や蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）を使用した、生細胞におけるタンパク質間相互作用およびタンパク質の空間的な関係を評価することがあげられます。

同じ細胞内の複数の蛍光タンパク質を同時検出することは従来、複数の蛍光標識抗体の検出よりも困難でした。これは、蛍光タンパク質が、抗体の標識に使用される従来の細胞色素や蛍光色素とは異なる、より幅広い蛍光スペクトルを持つためです。

Attune Flow Cytometerは、蛍光タンパク質分析を念頭に置いて開発されました。このことは、複数の蛍光タンパク質や蛍光標識抗体（個別または組み合わせ）の容易で正確な分析を可能にし、最大4つのレーザーと16の検出チャンネルで構成できます。

Detection of multiple fluorescent proteins expressed in the same cell. 293FT cells were transfected with two plasmids, either by sequential delivery of each plasmid separately (top panels), or in 1:1 (w/w) mixes (bottom panels), using Invitrogen Lipofectamine 3000 reagent. Transfected cells were grown for 48 hr prior to harvest and analysis by flow cytometry. Samples were acquired using the Attune NxT Flow Cytometer at a flow rate of 100 μL/min, and a minimum of 15,000 events were collected for each sample. All major cell populations are detected: cells expressing one of the fluorescent proteins, both fluorescent proteins and neither fluorescent protein (percentages are indicated on the plots). Cells expressing the Fluorescent Proteins are easily distinguished from non–fluorescent proteins-expressing cells. (A) The 405 nm and 561 nm lasers were used for excitation of TagBFP and mOrange2, respectively. (B) The 405 nm and 561 nm lasers were used for excitation of TagBFP and mKate, respectively. (C) The 488 nm and 561 nm lasers were used for excitation of emGFP and mKate, respectively.
 

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