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Annexin V conjugates are very useful for flow cytometry and confocal or epifluorescence microscopy and, like antibody staining, can be used in combination with other dyes, including nucleic acid stains, to accurately assess mixed populations of apoptotic and nonapoptotic cells.
弊社のアネキシンVコンジュゲートおよびアッセイは以下を提供します：
利用できる最良で最も明るいアネキシンVコンジュゲートMolecular Probesは、Nexins Research BV--蛍光ホスファチジルセリン結合タンパク質の最初の開発者--と共同研究しており、利用できる最良で最も明るいアネキシンVコンジュゲートであると弊社が考えるものを提供しています。ヒト血管抗凝固剤であるアネキシンVは、35～36 kDa、Ca2+依存性のリン脂質結合タンパク質であり、ホスファチジルセリン（PS）に高い親和性を有します。正常な生存細胞において、PSは細胞膜の細胞質側に局在しています。しかし、アポトーシス細胞では、PSは原形質膜の内層から外層に局在を変え、外部の細胞環境に露出するため、アネキシンVコンジュゲートにより検出することができます。白血球アポトーシスでは、細胞の外表面にあるPSが細胞の標識となることで、マクロファージによる認識とファゴサイトーシスを可能にしています。
フローサイトメトリー用アネキシンVコンジュゲート
非常に蛍光の強いアネキシンVコンジュゲートは、アポトーシスの中間ステージのインジケーターであるホスファチジルセリンの外在化を研究するための、迅速かつ信頼性の高い検出方法をもたらします。核フラグメンテーション、ミトコンドリア膜電位フラックスおよびカスパーゼ-3活性化は、明らかにアポトーシス中にホスファチジルセリンが"反転する"前に起こる一方で、propidium iodideに対する透過性および細胞骨格崩壊は、反転後に起こります。弊社の蛍光アネキシンVコンジュゲートで染色したアポトーシスと非アポトーシス細胞との間の、フローサイトメトリーにより測定される蛍光強度の差は、通常約100倍です。
アネキシンVコンジュゲートは、フローサイトメトリーおよび共焦点または落射蛍光顕微鏡法に非常に有用であり、抗体染色のように、核酸染色剤などの他の色素と組み合わせて使用することができるため、アポトーシスと非アポトーシス細胞の混合集団を正確に評価することが可能です。弊社のアネキシンVコンジュゲートは、独立型の試薬として利用可能であり、50～100のフローサイトメトリーアッセイ、より多くのイメージングアッセイ、またはフローサイトメトリー用の弊社のマルチパラメーター・アポトーシスアッセイのいくつかの変法のそれぞれに適しています。
- 感度—より明るいシグナルが得られる、Alexa Fluor®色素とのコンジュゲート
- 柔軟性—多くのレーザーおよび検出チャネルのためのコンジュゲート
- 簡便さ--通常、30分未満で終了するアッセイプロトコル
利用できる最良で最も明るいアネキシンVコンジュゲートMolecular Probesは、Nexins Research BV--蛍光ホスファチジルセリン結合タンパク質の最初の開発者--と共同研究しており、利用できる最良で最も明るいアネキシンVコンジュゲートであると弊社が考えるものを提供しています。ヒト血管抗凝固剤であるアネキシンVは、35～36 kDa、Ca2+依存性のリン脂質結合タンパク質であり、ホスファチジルセリン（PS）に高い親和性を有します。正常な生存細胞において、PSは細胞膜の細胞質側に局在しています。しかし、アポトーシス細胞では、PSは原形質膜の内層から外層に局在を変え、外部の細胞環境に露出するため、アネキシンVコンジュゲートにより検出することができます。白血球アポトーシスでは、細胞の外表面にあるPSが細胞の標識となることで、マクロファージによる認識とファゴサイトーシスを可能にしています。
フローサイトメトリー用アネキシンVコンジュゲート
非常に蛍光の強いアネキシンVコンジュゲートは、アポトーシスの中間ステージのインジケーターであるホスファチジルセリンの外在化を研究するための、迅速かつ信頼性の高い検出方法をもたらします。核フラグメンテーション、ミトコンドリア膜電位フラックスおよびカスパーゼ-3活性化は、明らかにアポトーシス中にホスファチジルセリンが"反転する"前に起こる一方で、propidium iodideに対する透過性および細胞骨格崩壊は、反転後に起こります。弊社の蛍光アネキシンVコンジュゲートで染色したアポトーシスと非アポトーシス細胞との間の、フローサイトメトリーにより測定される蛍光強度の差は、通常約100倍です。
アネキシンVコンジュゲートは、フローサイトメトリーおよび共焦点または落射蛍光顕微鏡法に非常に有用であり、抗体染色のように、核酸染色剤などの他の色素と組み合わせて使用することができるため、アポトーシスと非アポトーシス細胞の混合集団を正確に評価することが可能です。弊社のアネキシンVコンジュゲートは、独立型の試薬として利用可能であり、50～100のフローサイトメトリーアッセイ、より多くのイメージングアッセイ、またはフローサイトメトリー用の弊社のマルチパラメーター・アポトーシスアッセイのいくつかの変法のそれぞれに適しています。
| コンジュゲート | レーザー | 蛍光波長 | 推奨フィルター | サイズ | カタログ番号 |
|---|---|---|---|---|---|
| Alexa Fluor® 350標識アネキシンV | UV | 442 nm | 450/40 nm | 100アッセイ | A23202 |
| Pacific Blue™標識アネキシンV | 405/7 nm | 455 nm | 450/50 nm | 100アッセイ | A35122 |
| Alexa Fluor® 488標識アネキシンV | 488 nm | 519 nm | 530/30 nm | 100アッセイ | A13201 |
| R-PE標識アネキシンV | 488 nm | 578 nm | 585/42 nm | 50アッセイ | A35111 |
| Alexa Fluor® 555標識アネキシンV | 532 nm | 565 nm | 575/26 nm | 100アッセイ | A35108 |
| Alexa Fluor® 568標識アネキシンV | 561 nm | 603 nm | 610/20 nm | 100アッセイ | A13202 |
| Alexa Fluor® 594標識アネキシンV | 590 nm | 617 nm | 630/20 nm | 100アッセイ | A13203 |
| APC 標識Annexin V | 633/5 nm | 665 nm | 661/8 nm | 100アッセイ | A35110 |
| Alexa Fluor® 647標識アネキシンV | 633/5 nm | 660 nm | 661/8 nm | 50アッセイ | A23204 |
アポトーシスを誘発するようにカンプトテシンで処理したJurkat細胞を用いて、このアッセイを最適化しました。他のタイプの細胞を使用する場合、一部の改変が必要になる場合もあります。
1.1以下のアネキシン結合バッファーを調製します。10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2, pH 7.4。
1.2適当と思われる方法を用いて細胞のアポトーシスを誘発します。誘発剤を加えずに細胞をインキュベートすることにより、ネガティブコントロールを調製する必要があります。1.3 インキュベーションした後に細胞を回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。
1.4洗浄した細胞をペレット化し、上清を除き、アネキシン結合バッファー中で細胞を再懸濁します。細胞密度を測定した後、アネキシン結合バッファーで約1 × 106 cells/mLに希釈し、アッセイあたり100 μLを使用できる十分な量を調製します。
1.5 アネキシンVコンジュゲー ト5 μLを各細胞懸濁液 100 μLに加えます。propidium iodide、SYTOX® Green色素、またはSYTOX® AADvanced™ dead cell stainといった適切な死細胞インジケーターを添加することを望む場合があるかも知れません。
1.6 細胞を15分間室温でインキュベートします。
1.7 インキュベーションした後、アネキシン結合バッファー 400 μLを加えてやさしく混合し、サンプルを氷上で保冷します。
1.8できるだけ早く、染色した細胞をフローサイトメトリーで解析します。ビオチン-X標識アネシンVで染色した細胞には、蛍光物質で標識したストレプトアビジンなどの二次検出剤のアプリケーションが必要となります。細胞集団は次のような2群以上に分けなければなりません。極めて低レベルの蛍光を有する生細胞、および非常に高い蛍光強度を示すアポトーシス細胞。死細胞染色剤を用いた場合、死細胞は、死細胞染色試薬とアネキシンVコンジュゲートの両方で標識されます。
1.1以下のアネキシン結合バッファーを調製します。10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2, pH 7.4。
1.2適当と思われる方法を用いて細胞のアポトーシスを誘発します。誘発剤を加えずに細胞をインキュベートすることにより、ネガティブコントロールを調製する必要があります。1.3 インキュベーションした後に細胞を回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。
1.4洗浄した細胞をペレット化し、上清を除き、アネキシン結合バッファー中で細胞を再懸濁します。細胞密度を測定した後、アネキシン結合バッファーで約1 × 106 cells/mLに希釈し、アッセイあたり100 μLを使用できる十分な量を調製します。
1.5 アネキシンVコンジュゲー ト5 μLを各細胞懸濁液 100 μLに加えます。propidium iodide、SYTOX® Green色素、またはSYTOX® AADvanced™ dead cell stainといった適切な死細胞インジケーターを添加することを望む場合があるかも知れません。
1.6 細胞を15分間室温でインキュベートします。
1.7 インキュベーションした後、アネキシン結合バッファー 400 μLを加えてやさしく混合し、サンプルを氷上で保冷します。
1.8できるだけ早く、染色した細胞をフローサイトメトリーで解析します。ビオチン-X標識アネシンVで染色した細胞には、蛍光物質で標識したストレプトアビジンなどの二次検出剤のアプリケーションが必要となります。細胞集団は次のような2群以上に分けなければなりません。極めて低レベルの蛍光を有する生細胞、および非常に高い蛍光強度を示すアポトーシス細胞。死細胞染色剤を用いた場合、死細胞は、死細胞染色試薬とアネキシンVコンジュゲートの両方で標識されます。
Alexa Fluor® 488- Nelson Arispe et al.(2004) Hsc70 and Hsp70 interact with phosphatidylserine onthe surface of PC12 cells resulting in a decrease of viability.FASEB 18:1636–1645.
- James E. Kirby (2004) Anthrax lethal toxin induces human endothelial cell apoptosis.Infection and Immunity 72:430–439.
- Teresa Puig et al.(2008) Fatty acid metabolism in breast cancer cells: differential inhibitory effects of epigallocatechin gallate (EGCG) and C75.Breast Cancer Research and Treatment 109:471–479.
Pacific Blue™
- Timothy H Witney et al.(2009) A comparison between radiolabeled fluorodeoxyglucose uptake and hyperpolarized 13C-labeled pyruvate utilization as methods for detecting tumor response to treatment.Neoplasia 11: 574–582.
- Rachel L. Zemans et al.(2009) A novel method for long term bone marrow culture and genetic modification of murine neutrophils via retroviral transduction.Journal of Immunological Methods 340:102–115.
Alexa Fluor® 350
- Douglas L. Miller and Chunyan Dou (2009) Induction of apoptosis in sonoporation and ultrasonic gene transfer.Ultrasound Med Biology 35:144–154.
Alexa Fluor® 647とAPC
- Partha Mukhopadhyay et al.(2007) Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.Nature Protocols 2:2295–2301.
Alexa Fluor® 647
- Hajime Hiraragi et al.(2005) Human T-lymphotropic virus type 1 mitochondrion-localizing protein p13ii sensitizes Jurkat T cells to Ras-mediated apoptosis.Journal of Virology 79:9449–9457.
- Leonarda Troiano et al.(2007) Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry.Nature Protocols 2:2719–2727.
 Enlarge | Annexin V Alexa Fluor® 488 Conjugate Jurkat cells (T cell leukemia, human) treated with 10 μM camptothecin for 4 hours (right panel) or untreated (as control, left panel). Cells were then treated with Annexin V Alexa Fluor® 488 (Cat. No. A13201) to identify apoptotic cells and with propidium iodide (Cat. No. P3566) to identify dead cells, followed by flow cytometric analysis. Note that the camptothecin-treated cells (right panel) have a higher percentage of apoptotic cells (indicated by an “A”) than the basal level of apoptosis seen in the control cells (left panel). V = viable cells, D = dead cells. |
 Enlarge | Annexin V Alexa Fluor® 488 Conjugate Jurkat human T cell leukemia cells were treated with 1 μM camptothecin. The externalized phosphatidylserine, a characteristic of early-stage apoptotic cells, was detected with Annexin V Alexa Fluor® 488 (Cat. No. A13201). The late-stage apoptotic and necrotic cells were stained with propidium iodide (Cat. No. P3566). The image was acquired using bandpass filters appropriate for fluorescein. |
 Enlarge | Annexin V Alexa Fluor® 488 Conjugate Jurkat cells were induced with 10 µM camptothecin, then cells were washed and stained with Annexin V Alexa Fluor® 647 conjugate (Cat. No. A23204) and SYTOX® Green nucleic acid stain (Cat. No S7020). Cells were analyzed by flow cytometry using 488 nm and 633 nm excitation. |
 Enlarge | Annexin V Alexa Fluor® 568 Conjugate Jurkat cells were induced with 10µM camptothecin, then cells were washed and stained with Annexin V Alexa Fluor® 568 conjugate (Cat. No. A13202) and propidium iodide (Cat. No. P3566). Cells were analyzed using flow cytometry with 488 nm and 532 nm excitation and 585⁄42 nm emission and 610⁄20 nm bandpass filters |
 Enlarge | Annexin V Alexa Fluor® 350 Conjugate Jurkat cells were induced with 10 µM camptothecin, then washed and stained with Annexin V Alexa Fluor® 350 conjugate (Cat. No. A23202) and propidium iodide (Cat. No. P3566). Cells were analyzed using flow cytometry with 365 nm and 488 nm excitation.
|
 Enlarge | Annexin V Pacific Blue™ Conjugate Jurkat cells (T cell leukemia, human) were treated with 10 µM camptothecin for 4 hours. Cells were then treated with the reagents in the Pacific Blue™ Annexin V⁄SYTOX® AADvanced™ Apoptosis Kit (Cat. No. A35136) and analyzed by flow cytometry using 405 nm and 488 nm excitation. Note that the camptothecin-treated cells have a higher percentage of apoptotic cells (1B) than the basal level of apoptosis seen in the control cells (1A). A = apoptotic cells, V = viable cells, N = necrotic cells. |
 Enlarge | Annexin V APC Conjugate Jurkat cells were induced with 10 µM camptothecin, then cells were washed in annexin-binding buffer and stained with Annexin V APC (Cat. No. A35110) and SYTOX® Green (Cat. No. S7020). Cells were analyzed using flow cytometry with 488 nm and 633 nm excitation sources. |
 Enlarge | Annexin V PE Conjugate Jurkat cells were induced with 10 µM camptothecin, then cells were washed in annexin-binding buffer and stained with Annexin V PE (Cat. No. A35111) and SYTOX® Green (Cat. No. S7020). Cells were analyzed using flow cytometry with 488 nm excitation. |
製品は、研究目的にのみ使用できます。人体や動物に対する診断・治療用ではありません。
Resources
Fluorophore and reagent selection guide for flow cytometry
Download Flow Cytometry Protocols Handbook
Spectral Flow Cytometry Fundamentals
Invitrogen eBioscience Resources—Selection guides, Best Protocols, product performance and more.
Intracellular Staining for Flow Cytometry How-To Video—for detecting cytokines and intranuclear markers.
Flow Cytometry Learning Center—Access flow cytometry educational resources for better experiment planning and execution.
Flow Cytometry Panel Builder—Design your flow cytometry panel with this online tool for a simplified, customizable experience to fit your needs.
5 Steps Resources
Support
Flow Cytometry Support Center—Find technical support recommendations for your flow cytometry workflows, including tips for experimental setup and in-depth troubleshooting help.
Flow Cytometry Panel Design Support—Work with one of our technical sales specialists to discuss your experimental needs and guide you through the process.