核酸電気泳動の7つの注意点

電気泳動の基本的な原理によれば、サイズが異なる核酸は異なる移動度を示します。しかし、ヌクレオチドの数が同じでも配列組成やコンフォメーションが異なる核酸は、電気泳動において異なる移動度を示します（図 1）。

• 配列：分離能の高い電気泳動では、AT 含量の高い DNA は、同じサイズで GC 含量の高い DNA よりも遅く泳動されることがあります。同様に、約 10 bp 毎に 4 ～ 6 個のアデノシンリピートを持つ DNA 分子（curvedDNA と呼ばれる）は、特にポリアクリルアミドゲルで、不規則に泳動されます［1, 2］。これらの変則的な泳動は、分子のコンフォメーションに影響を及ぼす配列組成が原因となっているようです。
• コンフォメーション：環状 DNA や直鎖プラスミドのように、同じ配列でコンフォメーションの異なるDNA分子の泳動は、ゲル孔を通過する時の各分子のコンフォメーションのコンパクト性に左右されます。非常にコンパクトなスーパーコイル状の分子は最も速く、次いでフレキシブルな直鎖状、そして開環状の分子が泳動されます（図 1）。このような泳動の違いは、単離したプラスミド DNA の品質を調べる手段として役立つかもしれません。無傷なプラスミド DNA が、遺伝子過剰発現のための哺乳類細胞へのトランスフェクションのようなアプリケーションに必要となります。

分離される核酸サンプルのサイズと要求される分解能は、アガロースとポリアクリルアミドゲルのどちらを使用するかを決定する上で重要なポイントとなります（詳細は、2 つのゲルの選択を参照）。一般的に、ゲルのパーセンテージが高い方が、小さな分子に対する分解能は上がります。表 1 は、核酸電気泳動に使用するアガロースおよびアクリルアミドゲル試薬を選択する際に考慮すべき特性をまとめたものです。

表 1. 電気泳動に関連するアガロースおよびアクリルアミドゲル試薬の特性［3、4］

ゲルの厚みとウェルのサイズは、アガロースとポリアクリルアミドゲルの両方において、泳動結果に影響を及ぼします［3］。

一般的に、厚いゲルは、泳動中に発生する熱がより多いため、バンドの拡散を引き起こします。染色時のバックグラウンドが高くなったり、染色および脱色に時間がかかったりすることで、良好な染色結果が得られない場合があります（泳動後の染色を行う場合）。アガロースゲルの場合、一般的に 3 ～ 4 mm の厚さが良好な結果を与え、5 mm を超える厚さのゲルはお勧めしません。ポリアクリルアミドゲルの厚さは、メーカーによって提供されているゲルキャスティングプレートのスペーサーによって決まりますが、0.75 mm、1.0 mm、1.5 mm が一般的です。.

ゲル用コームの形によって決まるウェルのサイズは、導入できるサンプル量だけでなく、バンドの分解能にも影響を及ぼします。大きなウェルではサンプル導入量を増やすことができる一方、バンドが分厚くなるため、分解能が低下し、スメア状になることがあります。一方、長く狭いウェルではサンプル導入量は少ないですが、よりシャープで明確に分離されたバンドを与えます。コンパクトにサンプル導入できれば、少ない量でより高いバンド強度を得ることもできます。

核酸電気泳動に使用される一般的なバッファーは、トリス‐酢酸 EDTA（TAE）と Triトリス‐ホウ酸 EDTA（TBE）の 2 種類です［5］（詳細は、ゲルの泳動のセクションを参照）。高いイオン強度と緩衝能を持つ TBE バッファーは、分子量の小さなサンプル（例えば 1,000 bp 以下の DNA）を良好に分離しますが、大きな DNA 断片の分離にはあまり適していません。RNA のように二次構造をとる傾向にある分子の分離に使用される変性電気泳動には、通常TBE  バッファーが使用され、核酸を直鎖に保つために TB 7 ～ 8 M の尿素を含む TBE バッファーや同様の変性剤を用いてポリアクリルアミドゲルが作成されます。

分子量のより大きな核酸（例えば 12 ～ 15 kb 以上の DNA）の分離には、TAE バッファーを使用し、低い電場強度（1 ～ 2 V/cm）で泳動します。TAE バッファーはゲルの見かけポアサイズをより大きくし、電気浸透を減らします（比較的電荷の少ないバッファーです）。さらに電場強度を下げて泳動することで、大きな分子がスメア状になるのを防ぎます［6］。

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電気泳動によってサンプルを分離するために電圧をかけると、マイナスに荷電している核酸はプラスの電極に向かって泳動されます。そのため、電気泳動を支配する電気的なパラメーターは、サンプルの泳動とその成分の分離に大きな影響を及ぼします［7、8］。

オームの法則から導いた以下の式は、電圧（V）、電流（I）、そして電力（P）が、どのように泳動結果に影響し得るのかを表すのに使用できます。

ゲル電気泳動中の抵抗（R）は、系によって固有です。例えば、バッファー（導電率と緩衝能）、温度、ゲルの特徴（濃度、高さ、長さ、枚数、断面）などは全て、抵抗値に影響します。導電媒質の中では、温度が上がれば電流値が上がるので、抵抗値は下がります。しかし泳動の経過によって抵抗値は変化します。

電気泳動に影響を及ぼす別の重要な因子として、熱が挙げられます。熱は系によって消費される電力に比例し、バッファーの導電率、加電圧、そして抵抗に依存します。バッファーの導電率が高いと（特に小さなイオンの場合に）、電流はよく流れます。電圧が高く、抵抗が低い場合でも、電流値は上がります。全体的な電流値の上昇は、系によって生産される電力と熱を上昇させます。

表 2 は、電気泳動における定電圧、定電力、定電流の効果に対して、抵抗と熱がどのように影響するかをまとめたものです。過熱による機器やサンプルへのダメージを避けるためには、パワーサプライによって電気的パラメーターを一定にセットすることにこだわらず、システムが扱うことのできる最大値よりも少し低めに、電圧を設定する方がよいでしょう。過剰な熱を発生させないよう、サンプルを分離するのに十分な高さの電気的パラメーターに設定することをお勧めします。 

表 2. 電気泳動における電圧、電力、電流.

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蛍光色素は電気泳動を可視化するための核酸サンプルの染色に使用されます。感度に加え、励起波長、結合親和性、ゲルへの浸透性といったような色素の性質は、電気泳動のワークフローとアプリケーションに大きな影響を及ぼします（表 3）［9］。

表 3. 核酸染色に使用される蛍光色素の一般的な性質.

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核酸サンプル染色の一般的な 2 つの方法を以下に示します。

（1）色素をゲル内（および泳動バッファー）に含ませるゲル内染色
（2）泳動完了後に別の容器でゲルを染色する泳動後染色

表 4に示したように、2 つの方法はそれぞれに利点と留意点を持っています。

表 4. ゲル内染色と泳動後染色における利点と留意点.

ゲル内染色は簡便で、可視化に必要な色素も少量で済みます。しかし、プラスに荷電した色素分子は核酸の向きと反対に泳動され、特に長時間の泳動の場合、低分子の核酸の検出に影響を及ぼします（図 3A）。そのうえ、結合した色素は核酸の移動度を変えることがあるため（ゲルシフトとして知られる）、試料は正しいサイズの位置に泳動されなくなります（図 3B）。さらには、ゲルに含ませた高濃度のインターカレーティング色素は、スーパーコイルプラスミド DNA のコンフォメーションを変化させ、それらの電気泳動における移動度（見かけ分子量）を変化させる場合があります［10］。

泳動後染色は泳動中のサンプルには影響しないため、正確な分子量を得るために好まれる方法です。しかし泳動後染色は、ワークフローの時間を延ばし、またより多くの色素を使用するため、エチジウムブロマイドのような色素を使用する場合、多くの有害廃棄物を生み出すことになります。

結論として、ワークフローセットアップに加え、試薬、電気的パラメーター、そして方法を適切に選択することが、電気泳動による核酸の分離解析において最適な結果を得るために重要なのです。

参考文献

1. Carrera P, Azorín F (1994) Structural characterization of intrinsically curved AT-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res 22(18):3671–3680.
2. Stellwagen NC (2009) Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution. Electrophoresis 30 Suppl 1:S188–195.
3. Lee SV, Bahaman AR (2012) Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 41–56.
4. Chory J, Pllard JD (1999) Resolution and Recovery of Small DNA Fragments. In: Ausubel FM et al. (editors) Current Protocols in Molecular Biology. Supplementary 45: Unit 2.7.1–2.7.8.
5. Brody JR, Kern SE (2004) History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Anal Biochem 333(1):1–13.
6. Stellwagen NC (1998) Apparent pore size of polyacrylamide gels: comparison of gels cast and run in Tris-acetate-EDTA and Tris-borate-EDTA buffers. Electrophoresis 19(10):1542–1547.
7. Thermo Fisher Scientific Inc. (2015) Protein Gel Electrophoresis Technical Handbook.
8. Sheehan D (2009) Electrophoresis. In: Physical Biochemistry: Principles and Applications. West Sussex: Wiley. pp 147–198.
9. Thermo Fisher Scientific Inc (2010) Nucleic Acid Detection and Analysis. In: Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. pp 349–360.
10. Sigmon J, Larcom LL (1996) The effect of ethidium bromide on mobility of DNA fragments in agarose gel electrophoresis. Electrophoresis 17(10):1524–1527.