核酸電気泳動ワークフロー―主な 5 つのステップ

アガロースとポリアクリルアミドは、核酸電気泳動に使用される最も一般的なゲルです。どちらの素材も核酸の分離に適したポアサイズを持った三次元マトリクスを形成し、核酸と反応することもありません。ゲルマトリクスの濃度を変えることでポアサイズを調節でき、異なるサイズの核酸を効率よく分離することができます。

アガロースとポリアクリルアミドのどちらを選択するかは、主に核酸サンプルのサイズ幅と分離に必要な分解能によりますが、ゲルの調製とサンプルの回収方法についても考慮することがあります（Table表 1）。アガロースは、0.1 ～ 25 kb の核酸の分離に理想的なポアサイズを持ったマトリクスを形成します。一方、ポリアクリルアミドは、1 kb 未満の核酸の分離に適したより小さなポアサイズを形成します。 場合によっては、ポリアクリルアミドゲルを使用して、100 bp 未満の断片の一塩基分の違いを区別することも可能です［1］。

表 1. アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルの違い。

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ゲルを調製するためのアガロースは、一般的には粉末として入手されますが、近年では便利なタブレットタイプも利用できます。ワークフローを合理化し時間を節約するために、プレキャストのアガロースゲルも利用でき、泳動、染色、解析がセットになったシステムも利用可能です。

アガロースゲルの作成において、ゲル濃度は以下のように計算します。
ゲル％（w/v）＝（アガロースの g 数／バッファーのmL数）ｘ100％

蛍光の核酸染色を使用する場合、ゲルを調製する際に、適切な濃度で蛍光試薬を含ませることがあります（例：0.5 μg/mL のエチジウムブロマイド）（詳細は、ゲルの可視化を参照）。

表 2 長さの異なる DNA 断片の分離における、最適なアガロースゲルの濃度を示したものです［2］。一般的に、小さな断片の分離には、高濃度のゲルが適しています（図 2）。濃度の低いゲルは壊れやすくて扱い難く、一方、濃度の高いゲルは濁っていて可視化を妨害することがある点に注意してください。

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ポリアクリルアミドの構成成分—アクリルアミドと架橋剤であるビスアクリルアミドは粉末で利用されますが、ゲルを簡便に調製する際には予め作られているストック溶液を使用することが一般的です。粉末と液体は共に神経毒となることが知られており、扱いには防護用のラボウェアを使用するなどして注意する必要があります。ゲル内のアクリルアミドとビスアクリルアミドを合わせたトータルの濃度（％T）は、ポアサイズを左右し、その直径は通常 20 ～ 150 nm になります［5］。濃度が高い場合、ポアサイズは小さくなり、より小さな分子の分離に適します。表 3 は、一般的に使用されるゲル濃度を示しています［2］。

表 3. 核酸断片の分離におけるポリアクリルアミドの推奨濃度。変性ゲルは、直鎖状の一本鎖の核酸（サイズは塩基数で示される）の分離に使用され、非変性ゲルは、主に二本鎖核酸に使用されます（bp ＝ 塩基対）。

核酸の分離には、3 ～ 30％（％T）のポリアクリルアミドゲルが一般的に使用されます。％Tに加えて、トータルのアクリルアミドに対するビスアクリルアミド（架橋剤）の重量パーセンテージ（％C）も、ポリアクリルアミドゲルのポアサイズおよびサンプルの分離に影響を及ぼします（表 4）。

％T と ％C は、以下のように表されます。
％T（w/v）＝［アクリルアミドとビスアクリルアミドの g 数／バッファーの mL 数］ x 100％
％C＝［ビスアクリルアミドの g 数／アクリルアミドとビスアクリルアミドの g 数］ x 100％

表 4. ポリアクリルアミドゲルの一般的な組成［5］。

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アガロースとポリアクリルアミドゲルは、電気泳動におけて核酸の移動が可能な電気伝導性のあるイオン溶液を用いて作成されます。電気泳動では、同じ pH とイオン強度を維持するため、通常、ゲルと泳動バッファーの両方に同じタイプのバッファーを使用します。核酸電気泳動において最も一般的な2つのバッファーは、Tris-acetate with EDTA（TAE）と Tris-borate with EDTA（TBE）であり、核酸のマイナス電荷を生かすために、共に中性付近のpHを持っています（詳細は、 ゲルの泳動におけるバッファーの選択を参照）。

一重鎖 DNA や RNA の分析では、アガロースとポリアクリルアミドゲルはしばしば変性条件下で調製され、泳動されます。変性条件では、核酸を形成している水素結合が壊され、ヘアピンループのような二次構造の形成が抑えられます。そのため、変性条件での電気泳動は、RNA の分離解析によく使用されます。核酸電気泳動において、アガロースとポリアクリルアミドゲルに使用される一般的な変性バッファーには、以下に示したものが含まれます。

• アガロース： グリオキサールと DMSO を含む sodium phosphate バッファー、NaOH-EDTA バッファー、ホルムアルデヒドまたはホルムアミドを含むMOPSバッファー
• ポリアクリルアミド：尿素を含む TBE バッファー

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目的のバンドを良好に分離し、検出するためには、ゲルに導入する DNA の量を計算する必要があります。蛍光検出では通常、バンド当たり 1 ～ 100 ng の DNA で十分ですが、検出限界の量は使用する染色試薬に依存します（詳細は、核酸染色の性質を参照）［6］。サンプルやスタンダードのオーバーロードは、バンドのスメアリングやマスキングを起こし、特に断片のサイズが近い場合に分離が悪くなります（図 8A）。

ローディング色素を含むバッファーで調製したサンプルやラダーの溶液は、通常、ウェルボリュームの少なくとも 30％ を満たすようにアプライしてください。液量が少ない場合、溶液がウェル内にきちんと分配せず、バンドが歪んでしまいます（図 8B）。DNA 結合タンパク質や付着末端を含むサンプルでは、ゲルに導入する前に、サンプルを SDS を含むローディング色素で加熱処理する必要があるかもしれません。なぜなら、タンパク質の結合や DNA 断片同士の相互作用は、分離を悪くすることがあるからです（図 10B）。

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ゲル電気泳動では、サンプルに（必要ならスタンダードにも）ローディングバッファー（6X または 10X のストック溶液が一般的）を加えます。ローディングバッファーの成分は以下の通りです。

• グリセロールやスクロースのような比重を高める成分は、サンプルの粘度を高め、サンプルを確実にウェル内に沈ませます。
• Tris-HCl のような塩類は、サンプルのイオン強度とpHを整えます。ローディングバッファーの塩濃度が高いと、バンドが幅広くなったり、歪んだり、スメアになったりすることがあります。
• EDTA などの金属キレーターは、サンプル中のヌクレアーゼを阻害し、核酸の分解を防ぎます。
• 色素はサンプルに色を付け、ローディングや電気泳動をモニタリングしやすくし、時にpHを変化させます。ローディングバッファーによっては、サンプル中の様々なサイズの分子の泳動を効率よく追跡するために、1つ以上の色素を含むものもあります。

一般的に、ローディング色素は分子量が小さく、核酸と同じ方向に泳動させるため、マイナスに荷電した分子です。ある色素は pH 依存的に発色し、サンプルローディングと泳動におけるpH指示薬としての役割を果たします（図 9A）。一般的に使用される色素は、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、フェノールレッド、そしてオレンジ G です。ローディングバッファーを選ぶ時には、目的の核酸のマスキングを避けるため、特に分子サイズが似ている場合（図 9C）、色素の泳動位置に注意してください（ 図 9B、表5、6）。色素によるマスキングは、目的バンドの解析や定量に影響を及ぼし、結果の信頼性を低下させます。

時として、ローディングバッファーは、SDS、尿素、ホルムアミドのような界面活性剤や還元剤を含んでいます。これらの添加物は、核酸分子内、または分子間の相互作用を壊し、核酸の直鎖構造や一本鎖コンフォメーションを促進します。最適な分離結果を得るためには、変性剤を含むローディングバッファー中でサンプルを加熱した方がよいでしょう（図 10A）。酵素反応によって得た二本鎖 DNA の電気泳動では、サンプルの移動度が変化するのを防ぐために、SDS をローディングバッファーに加え、核酸とタンパク質の相互作用を外すことがあります（図 10B）。

表 5. アガロースとポリアクリルアミドゲルにおけるブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールFFの見かけの分子サイズ［2］。

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ゲル、スタンダード、そしてサンプルの調製が終われば、次に電気泳動が実施されます。ゲルが完全に固まってから、コームを外し、泳動バッファーを加えます。コームは、ゲルが裂けたり、ウェルが壊れたりしないように、しっかりとなめらかに上に向かって取り外します。コームを取り外し、バッファーを加えた後、ウェルに残っている気泡を注意深く取り除いてください。ポリアクリルアミドゲルでは、残ったアクリルアミドを除去するために、バッファーでウェルをしっかりと洗ってください。

電気泳動を開始した時、サンプルが陽極側に向かって動くようにするため、ウェルを陰極側にして水平ゲルを ゲルボックスにセットしてください（図 11A）。陽極は一般的に赤いので、「赤い方へ向けて泳動する」というふうに覚えておくと良いかもしれません。Vertical gel は、ウェルが上になるようにデザインされています（図 11B）。 

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緩衝能を持ったイオン溶液である泳動バッファーが、電流を流すだけでなく、pH の変化を防ぐためにゲルの泳動に使用されます。電気泳動の間、電子の流れによって陰極はより塩基性に、陽極はより酸性になり、その結果、水の電気分解と pH シフトが起こります（表 6）。水素および酸素ガスの発生により、電極から気泡が生じ、それが電気泳動のサインとなります。 理想的には、効率的な伝導性を確保するため、泳動バッファーとゲル調製用のバッファーは同じであるべきです。

表 6. 2つの電極で起こる化学反応と pH の変化

電気泳動におけるバッファーの選択は、サンプルのサイズ、泳動時間、泳動後のプロセスなどに依存し、トリス酢酸 EDTA（TAE）とトリスホウ酸 EDTA（TBE）の2つが、最も一般的なバッファーです（表 7）［2、7］。

• TAE バッファーは、1,500 bp を超える断片に適しており、バンドがスメアになりにくいという特徴を持っています。TAE バッファーは緩衝能が低いため、時間の短い泳動（2時間未満）に適しています。TAE バッファーによる長時間の泳動は、オーバーヒート、サンプルの変性および拡散を引き起こし、場合によってはゲルが溶解することもあります。
• TBEhaバッファーは高い緩衝能を持つため、オーバーヒートを起こしにくく、長時間の泳動に向いています。TBE バッファーは短い断片の分離に適していますが、dsDNA は泳動が遅くなることがあります。TBE バッファーは酵素を阻害するため、制限酵素反応、クローニング、そして PCR などの酵素反応を含むダウンストリームアプリケーションには向かないことがあります。

1X TAE や、0.5 ～ 1X TBE よりもイオン強度の高いバッファーを使用した場合、サンプルは速く泳動されますが、伝導度が高いため大量の熱が発生しやすく、その結果、サンプルの変性やゲルの損傷を引き起こします。

表 7. バッファー選択ガイド

乾燥を防ぎ、イオンをきちんと流れさせるため、ゲルは完全にバッファーに沈めてください（図 12A）。しかし、アガロースゲルのような水平ゲルを泳動する時には、ゲルを覆うバッファーの深さを 3 ～ 5 mm にしてください。過剰なバッファー（5 mm 超）は、核酸の移動度を低下させ、バンドの歪みとオーバーヒートを起こしやすくします。 

変性アガロースゲルはリン酸ナトリウムや MOPS などの異なるバッファーで作成されるため、泳動バッファーは TAE と TBE のどちらでもない点に注意してください（詳細は、変性ゲルの調製を参照）。使用するゲルに合った泳動バッファーを選択することが重要です（図 12B）。

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ゲルの泳動を開始するために、定電圧、定電流、または定電力のいずれかによってゲルに電位をアプライします（詳細は、電気泳動における電気的パラメーターの影響を参照）。5～10 V/cm に設定した定電圧モードが、核酸電気泳動において一般的に使用されます。

アプライする電圧（V）＝ 電極間の距離（cm） x 推奨される V/cm

電圧は使用する泳動バッファーの種類だけでなく、分離する DNA 断片のサイズによって調整することもあります（表 8）。通常、市販の核酸ラダーには、各製品中の断片の最適な分離のための推奨電圧値が提示されています。極端に低い電圧は核酸の泳動を遅らせ、小さな分子の拡散と分解能の低下を引き起こします（図 13A）。一方、電圧が極端に高い場合、分離不良とスメアリングを引き起こし、場合によってはバッファーがオーバーヒートし、バンドのスマイリングや、サンプルの変性が起きることがあります（図 13B）。

表 8. 断片のサイズごとの泳動条件［2］。

場合によっては、バッファーの冷却と加熱をコントロールするために、装置に温度プローブを取り付けても良いでしょう。2 時間を超える電気泳動では、冷却とバッファーの再循環によってサンプルの分離が改善することがあります。変性ゲルの場合、バッファーの温度を 55 °C まで上げることで核酸の一本鎖構造が促進され、結果を改善できることがあります。 

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ゲル電気泳動が完了した後は、サンプルを可視化する必要があります。核酸は通常の光では見えないため、可視化のための検出方法が必要となります。表 9 に示したように、利用可能な方法は、サンプルの検出においてそれぞれに異なる感度幅と利点を持っています［6］。

表 9. 一般的な核酸のゲル染色および検出方法。

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• 変異原性と廃棄処理：エチジウムブロマイドは変異原性が高いため、核酸電気泳動ワークフローをより安全にする、 毒性が低く特別な廃棄方法を必要としない蛍光色素が提供されています（図16）。
• 感度: 微量なサンプルの検出には、EtBr よりも感度の高い蛍光試薬が適しています（図 16）。一本鎖核酸の場合は、塩基スタッキングが少ないため、可視化により多くのサンプルあるいはインターカレーティング色素を必要とします。そのため、一本鎖核酸に優先的に結合する色素が、RNA 電気泳動などでは有効です。
• UV による損傷：UV 光の代わりに低エネルギーのブルーライトによって励起できる蛍光色素は、核酸の損傷を減らす上に、同等以上の感度を示します（図 17A）。従って、電気泳動におけるブルーライトの使用は、クローニングやシーケンシングのようなダウンストリームアプリケーションにおける成功率を改善します（図 17B）。

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色素による染色の代わりに、核酸の UV 吸収を利用したUV シャドーイングと呼ばれる方法によって、核酸を間接的に可視化できます［8］。この方法は、簡単な検出だけで十分であり、インターカレーティング色素の使用がダウンストリームアプリケーションに影響を及ぼすような、オリゴヌクレオチドや RNA の電気泳動による分離精製においてよく使用されます。UV シャドーイングによる検出には、ナノグラムからマイクログラムのサンプルが必要であり、UV の伝導と吸収の点から、ポリアクリルアミドゲルのように薄くて透過性の高いゲルが向いています。UV シャドーイングのプロトコルでは、検出を最大限に高めるため、電気泳動後にゲルをカセットから取り出し、透明なプラスチックフィルムで覆った後、UV‐蛍光薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートの上に置きます。ゲルを UV 照射すると、核酸バンドによる吸収が、TLC プレート上に影となって現れます（図 18）。目的サイズの影となった部分のゲルを切り出し、その後のプロセスに使用します。

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可視化の後、泳動結果の記録と解析のために、核酸ゲルは画像化されます。サンプルを蛍光試薬で染色した場合、可視化とゲルイメージの取得の両方のために、適した光源によって色素を励起する特別な装置が必要です。装置には、励起光源がゲルの上にある落射イルミネーター（手持ち UV ランプと同様）と、ゲルの下にあるトランスイルミネーターの2種類があります（図 19）。落射イルミネーターでは光源が遠くにあるので、サンプルが受けるエネルギーは少なめです。これは核酸に対する UV ダメージを低下させますが、ゲルのバンドシグナルもまた低くなります。一方、トランスイルミネーターは高いバンドシグナルを与えますが、ゲルの近くで放射するため、UV によるダメージは高くなります。

放射標識した核酸の電気泳動では、泳動後にゲルを X 線フィルムにさらすオートラジオグラフィーと呼ばれるプロセスによって画像を取得します。放射標識したバンドのシグナル強度は、デンシトメトリーによって定量できます。 

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結論として、核酸電気泳動ワークフローでは、サンプルの分離解析のために幾つものステップと試薬を用いています。ワークフローの利点と欠点を知るだけでなく、サンプルに適したツールを選択することで、分子生物学アプリケーションにおける電気泳動の結果を、大幅に改善することができるのです。

1. Stellwagen NC (1998) DNA Gel Electrophoresis. In: Tietz D (editor), Nucleic Acid Electrophoresis (Springer Lab Manual). Heidelberg: Springer. pp 1–53.
2. Green MR, Sambrook J (2012) Analysis of DNA. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp 81–156.
3. Yilmaz M, Ozic C, Gok I (2012) Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 33–40.
4. Lee SV, Bahaman AR (2012) Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 41–56.
5. Barril P, Nates Silivia (2012) Introduction to Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Matrices with Respect to their Detection Sensitivities. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 3–14.
6. Thermo Fisher Scientific Inc (2010) Nucleic Acid Detection and Analysis. In: Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. pp 349–360.
7. Brody JR, Kern SE (2004) History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Anal Biochem 333(1):1–13.
8. Hassur SM, Whitlock HW Jr (1974) UV shadowing--a new and convenient method for the location of ultraviolet-absorbing species in polyacrylamide gels. Anal Biochem 59(1):162–164.

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