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フラグメント解析ワークフロー
さらなる DNA 解析を実施
フラグメント解析には、一連の技術が含まれており、蛍光標識した DNA フラグメントがキャピラリー電気泳動（CE）で、内部スタンダードとの比較によりサイズ別に分離されます。CE による DNA シーケンシングは特定のフラグメントまたは遺伝子セグメントの特異的な塩基配列の決定に用いられるのに対し、フラグメント解析は特異的な DNA ターゲット用に設計されたプライマーを用いた PCR により生成した蛍光標識 DNA フラグメントのサイジング、相対定量およびジェノタイピング情報を提供します。
当社は、簡単なサンプル調製からピーク解析まで、フラグメント解析ワークフローの各ステップを簡素化する幅広い製品およびサービスを提供しています。
ビデオ：フラグメント解析の仕組みとは？
ワークフロー
プライマー
CE システム上でフラグメント解析を実施するためには、プライマーを目的の領域に隣接するように設計する必要があります。通常、電気泳動の前にプライマーを蛍光色素で標識してから、フラグメントを PCR で増幅します。 当社は、フラグメント解析での使用について検証済みの Applied Biosystems 5´ 蛍光標識プライマーおよびプライマーペアを提供しています。
主要な特長：
- カスタム 5´ 蛍光標識プライマー
- ラベルは 6-FAM、TET、VIC、HEX、NED、または PET 色素から選択可能
- すべてのオリゴが脱塩精製済み、ラージスケールの標識プライマーには HPLC 精製オプションをご用意
- お届けするスケールは選択可能
5’ 標識シングルプライマー
5’ 標識／非標識プライマーペア
| 製品番号 | サイズ | HPLC 収量 | 5' レポーター色素 | 数量 | 注文 |
|---|---|---|---|---|---|
| 450056 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 450059 | 80,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 450062 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304976 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304977 | 80,000 pmol | 5´標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304978 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304979 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304981 | 80,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304982 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
PCR マスターミックス
Invitrogen Platinum II Hot-Start PCR Master Mix は、迅速にフラグメント解析ランを行うことを可能とします。革新的なバッファー、高性能の Taq DNAポリメラーゼ、優れたホットスタート技術の組み合わせは、非常にタフなアプリケーションにおいても優れた PCR 結果を達成します。
主要な特長：
- 60 ℃のユニバーサルなプライマーアニーリングにより、手間のかかる最適化ステップを削減し、すべての PCR アッセイを同時に進行可能
- 組換え Taq ポリメラーゼの使用により、4 倍速い DNA 合成と阻害物質耐性、確実な増幅を実現
- Platinum ホットスタート技術により、室温での反応液調製が可能
- 2X マスターミックスフォーマットによりピペッティングステップが減少し、ピペッティングによる誤差を低減
マトリックススタンダードおよびサイズスタンダード
キャピラリー電気泳動の準備として、プライマーを標識している色素を正確に検出するために、ご使用のジェネティックアナライザ上で目的の DNA フラグメントの標識に選択される色素群に対するマトリックススタンダードに対応するスペクトルキャリブレーションを実施する必要があります。 電気泳動を実施する前に、各未知サンプルをサイズスタンダードおよび Hi-Di Formamide と混合します。サイズスタンダードは、サンプルピークのサイジングを可能とし、注入の変動を補正します。
お客様のワークフローに推奨される Applied Biosystems マトリックススタンダードおよび GeneScan サイズスタンダードについては、次の表をご覧ください。
最適なマトリックスおよびサイズスタンダードの選択
| DNA フラグメントの標識に用いる色素セット | 対応するマトリックススタンダード | 推奨サイズスタンダード | 使用可能なアプリケーション |
| Dye set E5: dR110 (blue), dR6G (green), dTAMRA (yellow), dROX (red | DS-02 | GeneScan 120 LIZ Size Standard (orange) | SNaPshot マルチプレックス解析 |
| GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | マイクロサテライト、LOH、キメリズム、ISSR、RFLP、T-RFLP、MSMSA | ||
| Dye set D: 6-FAM (blue), HEX (green), NED (yellow) | DS-30 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | カスタム フラグメント解析 |
| Dye set D: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow) | DS-31 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | カスタム フラグメント解析 |
| Dye set F: 5-FAM (blue), JOE (green), NED (yellow) | DS-32 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | マイクロサテライト |
AFLP | |||
| Dye set G5: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow), PET (red) | DS-33 | GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | マイクロサテライト |
| カスタム フラグメント解析 | |||
| Dye set J6: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow), SID (violet), TAZ (red) | DS-36 | GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | カスタム フラグメント解析 |
ジェネティックアナライザおよび機器用試薬
機器用消耗品
ユニバーサルなオールインワンカートリッジ
Applied Biosystems SeqStudio カートリッジは、キャピラリアレイ、POP-1 ユニバーサルポリマー、バッファー、およびポンプが統合されたシステム設計を有します。POP-1 ユニバーサルポリマーは、オールインワンカートリッジにより、同一プレート上で 1 回のランでサンガーシーケンシングとフラグメント解析を同時に実施できる柔軟性を提供します。本カートリッジは着脱可能で、装置内で最大 6 ヵ月安定しています。サンプルをロードし、カートリッジを挿入するだけで、ランを開始できます。
ポリマー
適切な Applied Biosystems ポリマーを使用することにより、再解析率を低下させ、高品質で再現性のあるデータを得ることができます。当社は、さまざまなニーズに対応した種々のポリマーケミストリを提供しています：
POP-4: ヒト認証アプリケーション、他のフラグメント解析アプリケーション、短い DNA フラグメント（<500 bp）
POP-6: 中サイズの DNA フラグメント（500–700 bp）
POP-7: 長い DNA フラグメント（>700 bp）
ビデオ: サンガーシーケンスまたはフラグメント解析の設定方法
当社は、フラグメント解析結果を閲覧および解析するための幅広い Applied Biosystems ソフトウェアソリューションポートフォリオを提供しています。当社のクラウドベースのプラットフォームに接続することで、いつでも、どこからでも データへのアクセス、データ解析、データ共有が可能です。
- Peak Scanner Module—ピークの同定およびフラグメントのサイジングを提供します
- Microsatellite Analysis Module—サイズに応じて DNA フラグメント混合物を分離し、解析することを可能にしますこの解析は、分離プロファイルを提供し、フラグメントサイズを正確に計算し、サンプル中に存在するマイクロサテライトアレルを決定します
- Gene Mapper Software—フレキシブルなジェノタイピングソフトウェアパッケージで、DNA サイズおよびアレルコールをレポートします。複数のアプリケーションの解析に対応しており、AFLP、LOH 、およびマイクロサテライト SNP ジェノタイピング解析が含まれます。
プライマー
CE システム上でフラグメント解析を実施するためには、プライマーを目的の領域に隣接するように設計する必要があります。通常、電気泳動の前にプライマーを蛍光色素で標識してから、フラグメントを PCR で増幅します。 当社は、フラグメント解析での使用について検証済みの Applied Biosystems 5´ 蛍光標識プライマーおよびプライマーペアを提供しています。
主要な特長：
- カスタム 5´ 蛍光標識プライマー
- ラベルは 6-FAM、TET、VIC、HEX、NED、または PET 色素から選択可能
- すべてのオリゴが脱塩精製済み、ラージスケールの標識プライマーには HPLC 精製オプションをご用意
- お届けするスケールは選択可能
5’ 標識シングルプライマー
5’ 標識／非標識プライマーペア
| 製品番号 | サイズ | HPLC 収量 | 5' レポーター色素 | 数量 | 注文 |
|---|---|---|---|---|---|
| 450056 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 450059 | 80,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 450062 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識プライマーペア | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304976 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304977 | 80,000 pmol | 5´標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304978 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304979 | 10,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304981 | 80,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
| 4304982 | 300,000 pmol | 5´ 標識／非標識 Di-Repeat + Tail | 6-FAM, TET, VIC, HEX, NED, PET | 2 チューブ | 注文する |
PCR マスターミックス
Invitrogen Platinum II Hot-Start PCR Master Mix は、迅速にフラグメント解析ランを行うことを可能とします。革新的なバッファー、高性能の Taq DNAポリメラーゼ、優れたホットスタート技術の組み合わせは、非常にタフなアプリケーションにおいても優れた PCR 結果を達成します。
主要な特長：
- 60 ℃のユニバーサルなプライマーアニーリングにより、手間のかかる最適化ステップを削減し、すべての PCR アッセイを同時に進行可能
- 組換え Taq ポリメラーゼの使用により、4 倍速い DNA 合成と阻害物質耐性、確実な増幅を実現
- Platinum ホットスタート技術により、室温での反応液調製が可能
- 2X マスターミックスフォーマットによりピペッティングステップが減少し、ピペッティングによる誤差を低減
マトリックススタンダードおよびサイズスタンダード
キャピラリー電気泳動の準備として、プライマーを標識している色素を正確に検出するために、ご使用のジェネティックアナライザ上で目的の DNA フラグメントの標識に選択される色素群に対するマトリックススタンダードに対応するスペクトルキャリブレーションを実施する必要があります。 電気泳動を実施する前に、各未知サンプルをサイズスタンダードおよび Hi-Di Formamide と混合します。サイズスタンダードは、サンプルピークのサイジングを可能とし、注入の変動を補正します。
お客様のワークフローに推奨される Applied Biosystems マトリックススタンダードおよび GeneScan サイズスタンダードについては、次の表をご覧ください。
最適なマトリックスおよびサイズスタンダードの選択
| DNA フラグメントの標識に用いる色素セット | 対応するマトリックススタンダード | 推奨サイズスタンダード | 使用可能なアプリケーション |
| Dye set E5: dR110 (blue), dR6G (green), dTAMRA (yellow), dROX (red | DS-02 | GeneScan 120 LIZ Size Standard (orange) | SNaPshot マルチプレックス解析 |
| GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | マイクロサテライト、LOH、キメリズム、ISSR、RFLP、T-RFLP、MSMSA | ||
| Dye set D: 6-FAM (blue), HEX (green), NED (yellow) | DS-30 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | カスタム フラグメント解析 |
| Dye set D: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow) | DS-31 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | カスタム フラグメント解析 |
| Dye set F: 5-FAM (blue), JOE (green), NED (yellow) | DS-32 | GeneScan 500 ROX Size Standard (red) | マイクロサテライト |
AFLP | |||
| Dye set G5: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow), PET (red) | DS-33 | GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | マイクロサテライト |
| カスタム フラグメント解析 | |||
| Dye set J6: 6-FAM (blue), VIC (green), NED (yellow), SID (violet), TAZ (red) | DS-36 | GeneScan 600 LIZ Size Standard v2.0 (orange) | カスタム フラグメント解析 |
ジェネティックアナライザおよび機器用試薬
機器用消耗品
ユニバーサルなオールインワンカートリッジ
Applied Biosystems SeqStudio カートリッジは、キャピラリアレイ、POP-1 ユニバーサルポリマー、バッファー、およびポンプが統合されたシステム設計を有します。POP-1 ユニバーサルポリマーは、オールインワンカートリッジにより、同一プレート上で 1 回のランでサンガーシーケンシングとフラグメント解析を同時に実施できる柔軟性を提供します。本カートリッジは着脱可能で、装置内で最大 6 ヵ月安定しています。サンプルをロードし、カートリッジを挿入するだけで、ランを開始できます。
ポリマー
適切な Applied Biosystems ポリマーを使用することにより、再解析率を低下させ、高品質で再現性のあるデータを得ることができます。当社は、さまざまなニーズに対応した種々のポリマーケミストリを提供しています：
POP-4: ヒト認証アプリケーション、他のフラグメント解析アプリケーション、短い DNA フラグメント（<500 bp）
POP-6: 中サイズの DNA フラグメント（500–700 bp）
POP-7: 長い DNA フラグメント（>700 bp）
ビデオ: サンガーシーケンスまたはフラグメント解析の設定方法
当社は、フラグメント解析結果を閲覧および解析するための幅広い Applied Biosystems ソフトウェアソリューションポートフォリオを提供しています。当社のクラウドベースのプラットフォームに接続することで、いつでも、どこからでも データへのアクセス、データ解析、データ共有が可能です。
- Peak Scanner Module—ピークの同定およびフラグメントのサイジングを提供します
- Microsatellite Analysis Module—サイズに応じて DNA フラグメント混合物を分離し、解析することを可能にしますこの解析は、分離プロファイルを提供し、フラグメントサイズを正確に計算し、サンプル中に存在するマイクロサテライトアレルを決定します
- Gene Mapper Software—フレキシブルなジェノタイピングソフトウェアパッケージで、DNA サイズおよびアレルコールをレポートします。複数のアプリケーションの解析に対応しており、AFLP、LOH 、およびマイクロサテライト SNP ジェノタイピング解析が含まれます。
もっと詳しく知るための資料
Seq It Out では、皆様の日常的なサンガーシーケンシングおよびフラグメント解析の疑問にお答えします。
シーケンシングの歴史および研究ニーズに合ったプラットフォームの選び方について学べます。